Инновации в оптической микроскопии (Часть1)

Пожалуй, не найдется ни одного из научных приборов, усовершенствованию которого было посвящено столько мыслей и усилий, сколько оптическому микроскопу. Источником развития оптических микроскопов в течение прошедших столетий всегда было стремление ученых наблюдать и исследовать все меньшие, трудно различимые явления, скрытые в тканях еще глубже, чем когда-либо ранее (рисунок 1).

Рис. 1. Эпителиальные клетки легочной артерии быка

Пример изображений, формируемых современными усовершенствованными микроскопами, иллюстрирует рисунок 1. Представленное цветное флуоресцентное изображение клеток культуры ткани получено при помощи микроскопа Eclipse E600 с флюоритовым объективом CFI60 40X и новой цифровой камеры Nikon DXM 1200.

Столетие назад микроскоп достиг предела разрешающей способности, определяемой классической теорией природы света. Однако, для исследования внутриклеточных процессов в реальном времени, микроскопу требовалась не только разрешающая способность. Методики, которыми ранее владели высококлассные специалисты единичных лабораторий, сегодня превратились в простые, рутинные клинические процедуры. Внимательно прислушиваясь к мнениям микроскопистов, разработчики микроскопов осуществили гигантские нововведения. Настоящая статья предлагает краткую сводку недавних усовершенствований конструкции микроскопа, акцентируя внимание читателя на том, как новейшая оптическая система может способствовать научному прогрессу.

Конечные и бесконечные оптические системы

В те времена, когда биологические микроскопы были сравнительно простыми, до разработки эпифлуоресцентного и конфокального методов, не было необходимости устанавливать между объективом и окулярами микроскопа (в межлинзовом пространстве) мощные (и соответственно массивные) оптические компоненты. Для этой цели прекрасно подходил стандартный тубус длиной 160 мм или 170 мм, между установочным фланцем объектива и установочным отверстием окуляра. Световой поток такого микроскопа сходится в межлинзовом пространстве. Металлургам и геологам нужен поляризованный свет. Поэтому, до изобретения очень тонких пластинчатых поляризаторов, в упомянутом межлинзовом пространстве приходилось устанавливать массивные призмы и другие элементы. В 1930-х годах, один из производителей, пытаясь выйти за пределы стандартного тубуса, и измученный проблемами коррекции аберраций, вносимых призмами, создал первый вариант бесконечной оптической системы.

Термин «бесконечная» означает, что каждая линза объектива проецирует изображение в бесконечность, а не на некотором, конечном, расстоянии. Такая бесконечная оптическая система формирует между объективом и окулярами параллельный световой пучок. В этот параллельный световой пучок можно устанавливать сложные оптические элементы, не создавая оптические аберрации и не уменьшая рабочие расстояния объективов. Кроме того, такая система сохраняет парфокальность при смене объективов (рисунок 2). На рисунке 2 представлена принципиальная схема оптического пути CFI60. Бесконечная оптическая система состоит из объектива, собирающей тубусной линзы и линзы окуляра. В параллельный оптический путь между объективом и тубусной линзой можно устанавливать модули и компоненты, образующие полностью универсальную систему без дополнительных оптических элементов переноса. Аксиальное и латеральное местоположения точки изображения, равно как и юстировка объектива и тубусной линзы, остаются неизменными.

Рис. 2. Оптический путь CF1₆₀

Разумеется, чтобы получить изображение, которое можно увидеть или зарегистрировать, световой пучок, вышедший из объектива «бесконечного» типа, необходимо снова сделать сходящимся при помощи тубусной линзы (или второго объектива), установленной между параллельным пучком и окулярами. Обычно, без ухудшения характеристик микроскопа, в этом пространстве можно установить два, и только в одном случае — три, основных компонента.

Сегодня стали возможными создание и установка компонентов, позволяющих достичь точно 1-кратного увеличения, что очень удобно при сравнении нескольких оптических методов, применительно к одному и тому же образцу. Например, в случае установки оптики для эпифлуоресценции и дифференциально-интерференционного контраста (ДИК), остается свободное пространство для третьего элемента — устройства изменения увеличения, обучающего модуля, многоканального узла для подключения двух видеокамер или промежуточного тубуса для использования с графическим планшетом при трассировке нейронов.

Годы тому назад конструкторы классических микроскопов могли позволить себе роскошь рассматривать объектив и окуляр, как одно целое в отношении коррекции аберраций линз, сферической и хроматической аберраций (продольных и поперечных), комы, астигматизма и кривизны поля изображения. Поперечная хроматическая аберрация (LCA), известная также как хроматическая разность (хроматизм) увеличения, представляет собой формирование в одной фокальной плоскости красного, зеленого и синего изображений разных (для каждого цвета) размеров.

Обычно, хроматическая аберрация очень трудно поддается исправлению, поэтому ее часто оставляли без исправления в объективе, с целью компенсации в окуляре. Выбор оптических стекол и компьютерных методов, имевших место еще несколько лет назад, был недостаточен для исправления хроматичекой аберрации непосредственно в объективе. Установка мощных компонентов в нескорректированный межлинзовый пучок могла только дополнительно нарушить оптическую компенсацию.

Даже сегодня не все производители достигли полной коррекции хроматической аберрации непосредственно в объективе. Новейшие стекла, разработанные компанией Nikon Inc. (Мелвилл, штат Нью-Йорк), обладают чрезвычайно низкой дисперсией, благодаря чему все аберрации корректируются непосредственно в объективе. Компания Nikon представила первые, полностью скорректированные объективы CF (без хроматической аберрации), в 1976 году. Эта новая технология получила дальнейшее развитие в объективах CFI60 (сфокусированный на бесконечность ахромат, с 60-мм парфокальной высотой плеча), тубусных линзах и окулярах (Nikon). Среди всех микроскопических элементов с тубусом «бесконечной» длины, только этот объединил в себе другие конструктивные изменения, необходимые для максимального использования преимуществ рассматриваемой концепции.

Новые линзы

Поскольку выходной пучок объектива необходимо сфокусировать в бесконечности, конструкция идеального объектива для бесконечной оптической системы микроскопа требует чего-то большего, чем обычный набор линз. Добавьте к этому требования флуоресцентных методов исследований, например, M-FISH (многоцветная флуоресцентная гибридизация in situ) (рисунок 3), которые основаны на получении максимально возможного количества фотоснимков и требуют объективов с высокой числовой апертурой (NA). Добавьте, также, требования конфокальных методик в отношении объективов с высокими значениями числовой апертуры и большими рабочими расстояниями, позволяющих проникать глубоко в толщу ткани. Чтобы удовлетворять всем перечисленным требованиям, современные объективы должны содержать линзы большого физического диаметра. Вместе взятые, эти требования делают прежние стандарты, регламентирующие размеры объективов, устаревшими. В качестве примера на рисунке 3 представлено цветное флуоресцентное изображение фибробласта, снятое на пленку через микроскоп Eclipse E800 с масляно-иммерсионным объективом CFI60 60X, NA = 1,4.

Рис. 3. Флуоресцентная гибридизация in-situ

Стандарт, устанавливающий размер резьбовых соединений объективов, был принят Королевским микроскопическим обществом Великобритании в 1800-е годы. Принятый размер, будучи вполне приемлемым для латунных микроскопов того времени, стал серьезным ограничением в разработке и проектировании оптических систем. Кроме того, прежние промышленные стандарты парфокальной высоты плеча (расстояние от образца до установочного фланца объектива), перестали соответствовать сложности современных конструкций. Новый стандарт (компании Nikon) — 25-миллиметровый диаметр резьбового соединения и 60-миллиметровая парфокальная высота плеча позволяет применять новые линзы и предоставляет достаточное пространство для модификаций. Тубусная линза с фокусным расстоянием 200 мм позволяет использовать объективы с очень большим рабочим расстоянием в сочетании с высокой числовой апертурой (NA). Новые стандарты и тубусные линзы делают возможным получать произвольные рабочие расстояния для таких объективов.

Объективы CFI60 обладают большей числовой апертурой, чем это доступно при стандартных увеличениях, что обеспечивает улучшенное разрешение деталей, а также повышенной светосилой и высокой производительностью в конфокальных микроскопах. Практически все объективы для микроскопов серии Eclipse имеют увеличенное рабочее расстояние. Это позволяет осуществлять фокусировку по всей толщине толстых образцов, без повреждения покровного стекла или объектива. Облегчается использование иммерсионного масла и смена образцов. Становится возможным использование камер с толстым дном, а также микроманипуляции с объективами более высокого увеличения.

В современных исследованиях внутриклеточных механизмов и динамической активности на счету каждый фотон флуоресцентного излучения. Для максимально эффективной регистрации таких фотонов требуются объективы с максимально возможной числовой апертурой. Масляно-иммерсионный объектив Plan Fluor наряду с 40-кратным увеличением и высокой числовой апертурой (1,30) формирует плоское поле, обеспечивает большое рабочее расстояние и обладает высоким пропусканием в ультрафиолетовой области спектра, оптимизированным для эффективного использования во флуоресцентных приложениях. Яркость изображения в эпископическом освещении для объективов с одинаковым увеличением пропорциональна четвертой степени числовой апертуры. Простой расчет показывает, что в сравнении со стандартным сухим объективом с числовой апертурой 0,65 и увеличением 40X, иммерсионный объектив с таким же увеличением и апертурой 1,30 дает в 16 раз более яркое изображение.

Улучшение качества изображений, получаемых через сухие объективы с большими коэффициентами увеличения

Многие наблюдения ведутся при помощи стандартных неиммерсионных объективов с увеличением 40X, так называемых, объективов для сухой иммерсии. При таком увеличении объектив должен иметь достаточно высокую числовую апертуру, чтобы выявить все разнообразие деталей, которое должно выявлять 40-кратное увеличение. Наименьшая числовая апертура современных 40-кратных объективов равна 0,65. Даже при такой числовой апертуре оптические характеристики микроскопа начинают зависеть от одного оптического компонента, неподвластного контролю конструкторов и изготовителей объективов — покровного стекла на образце. Изготовители микроскопов рекомендуют использовать покровное стекло толщиной 0,17 мм. На корпусе объектива делается специальная гравировка (в терминологии поставщиков лабораторного оборудования эта толщина соответствует покровному стеклу № 1 и ½).

Многие образцы приготавливаются с покровными стеклами иной (и различной) толщины. Это несущественно для наблюдений при малых увеличениях, но при 40-кратном и большем увеличениях оказывает сильное влияние на изображение. С точки зрения изготовителей объективов, нестандартные покровные стекла нарушают коррекцию сферической аберрации объектива; с точки зрения пользователей, — изображение теряет контрастность и выглядит мутным.

Числовая апертура, равная 0,65 является обычной для стандартных объективов с увеличением 40X; высококачественные сухие объективы могут иметь апертуру, равную 0,95. Толщина покровного стекла негативно влияет и на этот показатель, поскольку на объектив необходимо устанавливать коррекционное кольцо. Для оптимизации качества изображения коррекционное кольцо необходимо поворачивать, одновременно наблюдая за изображением. Вращение коррекционного кольца изменяет расстояние между некоторыми внутренними компонентами объектива, а это, к сожалению, изменяет его эффективное фокусное расстояние. На практике, оператор должен одной рукой вращать кольцо, а второй — рукоятку тонкой фокусировки, настраивая микроскоп на максимально резкое изображение. Многие пользователи так никогда и не овладевают такой техникой. В патентованной конструкции высокоапертурных сухих объективов Nikon с высоким коэффициентом усиления минимизирован сдвиг фокусировки, что позволяет легче оптимизировать качество изображения. Для числовых апертур больше 0,95 предлагаются иммерсионные объективы.

Универсальные объективы

В перечне продукции каждого изготовителя объективов имеются объективы для наблюдений не только в обычном светлом поле, но и с использованием иных методов, например, фазового контраста, ДИК и флуоресценции. Для однократного использования нескольких методик исследователи вынуждены покупать по нескольку таких объективов с соответствующим увеличением. До настоящего времени было невозможно создать единый объектив для всех методик, без существенного ухудшения его характеристик. Объективы Plan Fluor DLL компании Nikon работают во всех четырех упомянутых режимах без ухудшения качества изображения. Эти объективы удобны, а также экономят деньги и место в револьверном держателе объективов.

Объективы с минимальным увеличением

В повседневной жизни мы, обычно, сначала осматриваем объект вообще, и лишь затем концентрируемся на заинтересовавших нас деталях. В микроскопии начинают с малых увеличений, постепенно переходя к большим. Патологоанатомы, невропатологи и ботаники — одни из многих специалистов, которые часто используют малое увеличение для ориентации и буквально для «получения большой картинки». Однако, минимальное увеличение в микроскопах с объективами 10X и окулярами 10X составляет 100X — существенное отличие от натурального размера. Поскольку многие исследователи не хотят переходить на менее мощные окуляры, — наилучшим решением являются объективы с малым увеличением.

Рис. 4. Поле зрения при малых увеличениях

Объектив CFI60 0,5X позволяет вести наблюдение и съемку в широком поле зрения. Обладая полем зрения диаметром 50 мм, этот объектив удобен для макро-наблюдений больших образцов, например, тонкого среза ствола американской липы (см. рисунок 4). Площадь области изображения, формируемого этим объективом, более чем в пять раз превышает аналогичный параметр традиционной бесконечной оптической системой. Возможна съемка с истинным размером на 35 мм фотопленку.

Ведущие производители выпускают объективы с номинальным увеличением 4X, 2X и даже 1X. Объектив CFI Macroplan с увеличением 0,5X, со специальными приспособлениями дает в окулярах изображение с увеличением 5X, что позволяет получать на 35-миллиметровой фотопленке изображение в натуральную величину (с увеличением 1X) (см. рисунок 4). Этот объектив обеспечивает чрезвычайно высокий уровень детализации и хроматической коррекции, и до предела расширяет диапазон увеличения микроскопа.

Эргономичная конструкция

Микроскоп — это больше, чем просто оптическая система. Это лабораторный прибор, с которым ученый имеет самый тесный физический контакт. Приобретая прибор, за которым исследователь может проводить многие часы кряду, жизненно необходимо учитывать фактор физического комфорта. Это тот аспект, который невозможно просто взять и указать в листе технических параметров. Его необходимо прочувствовать на себе.

Во многих микроскопах предыдущих поколений (и даже в моделях совсем недавних лет), различные органы управления располагаются в местах, удобных изготовителю. Иногда это приводит к затруднениям и неудобствам. Сегодня ведущие производители учитывают эргономические аспекты в конструкции штативов, однако, в приборах серии Eclipse вопросы эргономики подняты на еще более высокий уровень. В конструкциях учтены результаты обширных исследований поз, в которых пользователи сидят за своими приборами, измерений удобных манипуляционных расстояний и определения удобных положений рук и головы. Рисунок 5(a) иллюстрирует расположение рукояток перемещения предметного столика и фокусировки микроскопа E800 в сравнении с традиционными микроскопами. Естественная поза и одинаковое расстояние кистей обеих рук от туловища снижают напряжение. Кроме того, рукоятки перемещения предметного столика и рукоятки фокусировки расположены таким образом, что ими можно управлять одной рукой, что повышает комфортность работы. Микроскопы многих моделей компании Nikon оснащаются прямыми и наклоняемыми окулярными тубусами, с изменяемым углом наклона (рисунок 5(b)), что повышает эффективность и комфортность работы за счет естественной позы оператора.

Рис. 5. Эргономическая конструкция микроскопа

Более того, в межлинзовом пространстве прежних конструкций не всегда удобно устанавливать дополнительные компоненты. В том случае, когда компоненты просто устанавливаются в ряд, как это делает большинство производителей, поверх которого располагается бинокулярная насадка, пользователь вынужден вытягивать шею, чтобы заглянуть в окуляры. В межлинзовое пространство микроскопа Eclipse можно установить до трех компонентов, не изменяя постоянную и удобную для наблюдения позу оператора (высоту расположения глаз).

В штативах новых моделей наиболее часто использующиеся органы управления располагаются в местах, максимально удобных для оператора, независимо от сложности изготовления. Совместно использующиеся органы управления, например, рукоятки перемещения столика и тонкой фокусировки, располагаются так, чтобы ими можно было управлять пальцами одной руки. При комфортно опирающихся на стол предплечьях, наиболее часто использующиеся органы управления естественным образом попадают под кончики пальцев рук. Низкое расположение предметного столика делает удобной смену предметных стекол. Органы управления предметным столиком можно устанавливать как с правой, так и с левой стороны.

Среди других новшеств в конструкциях штативов следует отметить существенно улучшенную временнýю и температурную стабильность, что очень важно для продолжительных, например, митотических и эмбриологических исследований. Кроме того, улучшено демпфирование вибраций, что повышает качество получаемых изображений.

Заключение

Означает ли все сказанное, что создан окончательный вариант оптического микроскопа? Несмотря на то, что современные измерительные приборы подняли микроскопию на весьма высокий уровень развития, мы, вероятно, никогда не будем удовлетворены результатами, достигнутыми в ходе научных исследований. Будущие задачи потребуют инноваций, которых мы сегодня не можем даже предвидеть. Однако, лучшие современные измерительные приборы обеспечивают несравнимо большую эффективность и универсальность, чем можно было себе представить еще несколько лет назад.

Введение в поляризационную микроскопию

Несмотря на довольно пренебрежительное отношение и недооценку в качестве исследовательского инструмента, поляризационная микроскопия не только обладает всеми преимуществами светлопольной микроскопии, но и предоставляет возможности для получения дополнительной информации, недоступной для других методов оптической микроскопии.

Рис. 1. Конфигурация поляризационного микроскопа

Помимо предоставления информации о цвете поглощения и границах раздела между минералами с различными показателями преломления, что доступно и в светлопольной микроскопии, поляризационная микроскопия позволяет различать изотропные и анизотропные материалы. В этой методике используются оптические свойства анизотропных сред, благодаря чему удается получить подробные сведения о структуре и составе материалов, что трудно переоценить в идентификационных и диагностических задачах.

Оптические свойства изотропных материалов, в состав которых входят газы, жидкости, ненапряженные стекла и кубические кристаллы, одинаковы по всем направлениям. Коэффициент преломления в каждом из них одинаков по всем направлениям, благодаря чему для них отсутствуют ограничения на направление распространения колебаний волн проходящего света. Напротив, оптические свойства анизотропных материалов, каковыми являются 90% всех твердых веществ, зависят от взаимной ориентации падающего света и кристаллографических осей. Такие вещества характеризуются рядом показателей преломления, в зависимости от направления распространения света в них и от координат плоскости колебаний. Но, что еще более важно, анизотропные материалы работают, как светоделители и расщепляют световой луч на две составляющие (см. рисунок 1). Для получения информации об этих материалах, в поляризационной микроскопии используется интерференция упомянутых составляющих расщепленного светового потока при их воссоединении в той же оптической системе.

Наибольшую известность микроскопия в поляризованном свете получила благодаря своему применению в геологии, главным образом, для изучения минералов в тонких шлифах горных пород. Тем не менее, она с успехом может применяться и для изучения многих других материалов. К таким материалам можно отнести очищенные, извлеченные или изготовленные природные и промышленные минералы, композиты, например, цемент, керамику, минеральные волокна и полимеры, а также кристаллические структуры или высокоупорядоченные биологические молекулы, например, ДНК, крахмала, древесины и мочевины. Поляризационную микроскопию можно использовать в качественных и количественных исследованиях, благодаря чему она является прекрасным инструментом в сфере материаловедения, геологии, химии, биологии, металлургии и даже медицины.

Рис. 2. Коноскопические интерференционные картины

Несмотря на то, что понимание аналитических методов поляризационной микроскопии, возможно, более требовательно, чем для других видов, ее следует использовать хотя бы для получения более точной информации, чем это можно сделать по методу светлого поля. Кроме того, знание принципов поляризационной микроскопии абсолютно необходимо для правильного понимания микроскопии по методу дифференциально-интерференционного контраста (ДИК).

Поляризованный свет

Согласно волновой модели света колебания его электрической и магнитной составляющей происходят под прямыми углами к направлению распространения и равновероятно по всем направлениям. Это «обычный» свет. В случае плоскополяризованного света существует только одно направление колебаний (рисунок 1). Система «глаза — мозг» человека нечувствительна к направлению световых колебаний. Поэтому, плоская поляризация света может восприниматься человеком в виде неких изменений интенсивности или цвета, например, как уменьшение яркости (блеска) при наблюдении через поляризованные солнцезащитные очки.

Наиболее распространенным поляризатором является пленка PolaroidTM. Изобретенная Лэндом (Land) в 1932 году, эта пленка состоит из длинных полимерных цепей. Пленка обрабатывается светопоглощающими красителями и растягивается так, что ее полимерные цепи выстраиваются в одном направлении. Световые волны с колебаниями, параллельными полимерным цепям, поглощаются, а с перпендикулярными — пропускаются.

В поляризационном микроскопе имеются два поляризационных фильтра — поляризатор и анализатор (см. рисунок 1). Поляризатор располагается под столиком с образцом. Как правило, разрешенное направление колебаний в поляризаторе фиксировано в направлении слева направо (восток-запад), хотя, обычно, поляризатор можно поворачивать на 360 градусов. В анализаторе, который располагается над объективами и, при необходимости, может извлекаться из оптической системы, ось разрешенных колебаний проходит обычно, в направлении «север-юг», но в некоторых микроскопах также может поворачиваться. В оптической системе микроскопа анализатор и поляризатор устанавливаются так, что их разрешенные направления колебаний перпендикулярны друг другу. При таком взаимном расположении поляризатора и анализатора свет не проходит через систему, и в окулярах микроскопа наблюдается темное поле зрения.

Поляризатор и анализатор являются неотъемлемыми элементами поляризационного микроскопа, однако, вдобавок к ним желательно иметь следующие компоненты:

• Поворотный предметный столик — для облегчения ориентации и центрирования объективов и предметного столика относительно оптической оси микроскопа, с тем, чтобы центр вращения совпадал с полем зрения.
• Ненапряженные объективы — в поляризованном свете напряжение может вызывать оптические эффекты, усложняющие наблюдение.

Гнездо для установки компенсаторов/компенсационных пластин между поляризатором и анализатором, для увеличения разности оптических путей в образце. В большинстве современных микроскопов это гнездо находится в револьверном держателе объективов микроскопа или в промежуточном тубусе, расположенном между корпусом и окулярными тубусами. Таким образом, установленные в это гнездо компенсационные пластины располагаются между образцом и анализатором.

Для поляризационной микроскопии используется как отраженный, так и проходящий свет. Отраженный свет удобен для изучения непрозрачных материалов, таких, как оксиды и сульфиды минералов, металлы и кремниевые пластины (рисунок 3). Техника отраженного света требует специального набора объективов, нескорректированных для наблюдения через покровное стекло, а объективы, предназначенные для работы в поляризованном свете, должны быть, к тому же, свободны от напряжений.

Рис. 3. Поляризационная микроскопия в отраженном свете

На рисунке 3 представлен ряд микрофотографий типичных образцов, полученных с использованием описываемой методики в отраженном поляризованном свете. Слева (рисунок 3(a)) представлено цифровое изображение поверхностных деталей микропроцессорной ИС. На снимке, представляющем фрагмент АЛУ микропроцессора, ясно видны элементы двойного лучепреломления, использованные при изготовлении кристалла. Представленная на рисунке 3(b) полированная поверхность керамической сверхпроводящей ленты (иттрий-1,2,3) демонстрирует кристаллические области двойного лучепреломления с интерференционными цветами, разбросанными в кристаллической решетке изотропного связующего слоя. В отраженном поляризованном свете видны, также, тонкие металлические пленки. Рисунок 3© иллюстрирует пузыри, образующие дефекты в сплошной (в других отношениях) тонкой медной пленке (толщиной около 0,1 мкм), лежащей между слоями подложки из хлорида никеля/натрия, и образующей вместе с этими слоями металлическую сверхструктуру.

Для получения хороших результатов необходимо тщательно подготовить образец. Выбранный метод зависит от типа исследуемого материала. В геологических исследованиях стандартная толщина тонких шлифов горных пород составляет 25–30 микрометров. Образцы должны быть отшлифованы на шаржированном алмазом шлифовальном круге, а затем вручную доведены до нужной толщины с использованием абразивных порошков, при постепенном уменьшении их зернистости. Образцы из более мягких материалов можно готовить аналогично биологическим образцам, используя микротом. Для наблюдений в проходящем свете используются срезы толщиной от одного до 40 микрометров. Срезы должны быть ненапряженными и не иметь следов режущего инструмента. Образец помещается между предметным и покровным стеклом, с использованием заливочной среды, состав которой определяется химической и физической природой образца. Последнее особенно важно при изучении синтетических полимеров, поскольку некоторые среды могут вступать в реакцию с исследуемым материалом, вызывая в нем структурные изменения.

Использование анизотропии

Плоскополяризованный свет позволяет получать информацию различных уровней (без анализатора в оптической системе) или с перекрестными поляризаторами (с анализатором в оптической системе). Наблюдения в плоскополяризованном свете позволяют выявить детали оптического рельефа образца, проявляющиеся в виде «различимости» границ; эта «различимость» возрастает при увеличении показателя преломления вокруг упомянутых деталей. Степень рассеяния света, при выходе из неровной поверхности образца, определяется разностью в показателях преломления монтажного клея и образца. Горельефные образцы, которые выглядят выступающими из изображения, обладают показателями преломления, существенно отличающимися от показателя преломления клея (гистологической среды). Показатели преломления материалов, (для которых эти показатели неизвестны), определяются с помощью иммерсионной рефрактометрии, путем сравнения с известными показателями преломления масел.

Исследование прозрачных или полупрозрачных материалов в плоскополяризованном свете аналогично наблюдению при естественном освещении, пока образец не поворачивается вокруг оптической оси микроскопа. При вращении можно видеть изменения яркости и/или цвета исследуемого материала. Такой плеохроизм, т. е., изменение цвета поглощения с изменением направления колебаний световых волн, зависит от ориентации материала на пути прохождения света и свойствен только анизотропным материалам. Примером материала, проявляющего плеохроизм, является крокидолит, более известный, как голубой (синий) асбест. Эффект плеохроизма помогает выявлять упомянутый материал.

Рис. 4. Цветовая шкала интерференционных цветов Майкла-Леви

Поляризационные цвета возникают в результате интерференции двух составляющих, на которые свет разделяется анизотропным образцом. Эти составляющие могут рассматриваться, как белый свет за вычетом деструктивно интерферировавших (уничтоженных) цветов. Рисунок 2 иллюстрирует коноскопические изображения одноосного и двуосного кристаллов, наблюдаемые в задней фокальной плоскости объектива. Интерференционные картины формируются лучами света, проходящими вдоль разных осей наблюдаемого кристалла. Одноосные кристаллы (рисунки 2(a) и 2(b)) демонстрируют интерференционную картину, состоящую из двух пересекающихся черных полос (изогир) в виде мальтийского креста. При освещении образцов двойного лучепреломления белым (поляризованным) светом формируется круговое распределение интерференционных цветов (рисунок 2). Внутренние круги (изохромы) состоят из расположенных в порядке возрастания цветов низшего порядка (см. цветовую шкалу интерференционных цветов Майкла-Леви, рисунок 4). Общий центр черного креста и изохром называется «мелатоп», и обозначает источник световых лучей, проходящих вдоль оптической оси кристалла. Двуосные кристаллы демонстрируют два мелатопа (рисунок 2©) и намного более сложную картину интерференционных колец.

Две составляющие светового потока проходят через образец с разными скоростями и испытывают различные степени преломления. Двойное лучепреломление — это численная разница между упомянутыми степенями (углами) преломления. Более быстрый луч первым выходит из образца, вследствие разности оптических путей (OPD), которую можно рассматривать в качестве «выигрышной разницы» в отношении более медленного луча. Анализатор воссоединяет только те компоненты двух лучей, которые распространяются в одном и том же направлении и с волновыми колебаниями в одной и той же плоскости. Для достижения максимального контраста, конструкция поляризатора обеспечивает одинаковую амплитуду двух лучей на момент их воссоединения.

В зависимости от разности оптических путей в образце и от длины волны света, в анализаторе возникает усиливающая и ослабляющая интерференция, что можно определить по порядку поляризационного цвета (цветов). Это явление обусловлено свойствами образца, включая толщину, разность показателей преломления и двойное лучепреломление для двух лучей, максимальное значение которого зависит от образца и от направления распространения света в нем. Разность оптических путей можно использовать для извлечения из образца полезной информации о «наклоне».

Информация, наложенная на цвет поляризации представляет собой элемент интенсивности. При повороте образца относительно поляризаторов интенсивность поляризационных цветов изменяется циклически — от нуля (гашение) до максимума после поворота на 45 градусов, и снова до нуля — после поворота на 90 градусов. Именно поэтому вращающийся предметный столик и центрирование являются критичными факторами для поляризационного микроскопа. Центрирование объектива и предметного столика обеспечивает совпадение оси вращения последнего с центром поля наблюдения — серьезный аспект обеспечения нормальной работы, что хорошо известно тем, кто пытался обходиться без такого центрирования.

Всякий раз, когда образец находится в положении ослабления (гашения), разрешенные направления колебаний проходящих световых волн параллельны разрешенным направлениям колебаний в поляризаторе или анализаторе. Эти направления связаны с геометрическими свойствами образца, такими, как длина волокон, направление экструзии пленки и грани кристаллов. Использование скрещенных поляризаторов позволяет легко отличать изотропные материалы от анизотропных, поскольку при повороте предметного столика на 360 градусов они постоянно находятся в положении интерференционного ослабления (остаются темными).

Для облегчения идентификации быстрых и медленных лучей, или для повышения контрастности, — в случае поляризационных цветов низшего порядка, например, темно-серого, в оптическую систему можно устанавливать вспомогательные пластины. Такие пластины изменяют цвета образца, интерпретировать которые позволяет шкала поляризационных цветов (таблица Майкла-Леви, рисунок 4). Такие таблицы показывают поляризационные цвета для значений разности оптических путей в диапазоне от 0 нм до 1800–3100 нм, наряду со значениями двойного лучепреломления и толщины. Волновая пластина создает собственную разность оптических путей. Когда свет проходит сначала через образец, а затем — через вспомогательную пластину, разности оптических путей пластины и образца либо складываются, либо вычитаются одна из другой, и вычисляются значения «выигрышной разницы» двух последовательных проходов. В том случае, когда направление колебаний медленного луча в образце и вспомогательной пластине совпадают, разности оптических путей складываются, когда же направление колебаний быстрого луча в образце совпадает с направлением колебаний медленного луча во вспомогательной пластине — вычитаются. Если направления колебаний медленного и быстрого лучей во вспомогательной пластине известны (обычно, указываются на оправах пластин промышленного изготовления), то можно определить соответствующие направления и в образце. Поскольку эти направления являются характеристическими для различных сред, их стоит определить, чтобы использовать для изучения ориентации и напряжения.

Рис. 5. Волокна хризотилового асбеста в поляризованном свете

Сильные стороны поляризационной микроскопии лучше всего проиллюстрировать на примере конкретных исследований и сопутствующих снимков. Все, приведенные в настоящем разделе изображения были получены с помощью сконструированного специально для научно-аналитических исследований микроскопа Nikon Eclipse E600, оборудованного для поляризационной микроскопии.

Идентификация асбестовых волокон

Асбест — это видовое обозначение группы природных минеральных волокон, широко использующихся, например, для изготовления изоляционных материалов, тормозных колодок и армирования бетона. При вдыхании асбестовые волокна опасны для здоровья, поэтому, важно уметь легко обнаруживать их в окружающей среде. Обычно, образцы исследуются при помощи сканирующей электронной микроскопии и рентгеновского микроанализа, однако, поляризационная микроскопия представляет более быструю и простую альтернативу, которую можно использовать для отличия асбестовых волокон от прочих, а также для определения типа асбеста — хризотила, крокидолита и амозита. С точки зрения охраны здоровья, считается, что разновидности амфибольного асбеста (крокидолит и амозит) более опасны, чем серпентин и хризотил.

Плоскополяризованный свет предоставляет информацию об общей морфологии волокна, о его цвете, плеохроизме (многоцветности) и показателе преломления. Вращение в плоскополяризованном свете не влияет на вид стеклянных волокон, тогда как волокна асбеста проявляют некоторый плеохроизм. В плоскополяризованном свете элементарные волокна хризотилового асбеста могут выглядеть изогнутыми, как завитые или поврежденные волосы, а волокна крокидолита и амозита выглядят прямыми или слегка изогнутыми. Хризотил имеет показатель преломления около 1,550, амозит — 1,692 и крокидолит — 1,695.

Используя скрещенные поляризаторы можно дедуктивным методом определить разрешенное направление колебаний световых волн при прохождении через образец, а при помощи полноволновой пластины — направления колебаний быстрой и медленной составляющей светового луча (рисунок 5). При скрещенных поляризаторах хризотил проявляет бледные интерференционные цвета — белые низшего порядка (рисунок 5(a)). При добавлении полноволновой пластины (530–560 нанометров) цвета изменяются. При ориентации в направлении «северо-восток — юго-запад», полноволновая пластина является аддитивной, и окрашивает волокна в синий и желтый цвета (рисунок 5(b)). В ориентации «северо-запад — юго-восток» (рисунок 5©) пластина является вычитающей, и дает светло-желтую окраску волокон, без синего цвета. Исходя из вышесказанного, можно определить, что направление колебаний медленного луча параллельно продольной (длинной) оси волокна. Амозит в этом отношении аналогичен хризотилу.

Рис. 6. Тонкий шлиф филлита в поляризованном свете 

Крокидолит демонстрирует синие тона, плеохроизм и густые коричневые поляризационные цвета. Направление колебаний быстрого луча параллельно продольной оси. Итак, идентификация трех типов асбестовых волокон зависит от их формы, показателей преломления, плеохроизма, двойного лучепреломления, а также от направлений колебаний быстрого и медленного лучей.