Основы стереомикроскопии

Стереоскопические микроскопы, учитывая широкий спектр имеющихся сегодня на рынке принадлежностей для них, можно смело назвать чрезвычайно полезными приборами для решения самых разных задач. Все производители выпускают штативы и основания с осветителями, позволяющие различными способами улучшать контрастность, и адаптируемые практически к любой рабочей ситуации. Для стереоскопических микроскопов (стереомикроскопов) предлагается широкий ассортимент объективов и окуляров, характеристики которых можно улучшать дополнительными линзами и коаксиальными осветителями, устанавливаемыми на микроскоп в виде промежуточного тубуса. Диапазон рабочих расстояний простирается от 3–5 сантиметров и (для некоторых моделей) до 20 сантиметров, что обеспечивает значительное рабочее пространство между объективом и образцом.

Введение в стереомикроскопию

Стереомикроскопы обладают характеристиками, очень полезными в ситуациях, где требуется трехмерное наблюдение, а восприятие глубины и контрастности критично для интерпретации структуры образца. Кроме того, такие микроскопы насущно необходимы для микроманипуляций образца в большом и удобном рабочем пространстве. Широкое поле зрения и переменное увеличение стереомикроскопов делают их весьма удобными для конструирования миниатюрных промышленных сборок, а также для биологических исследований, где необходимо манипулировать хрупкими и чувствительными живыми организмами.

Первый микроскоп стереоскопического типа с двумя окулярами и парой одинаковы[ объективов был разработан Керубином д’Орлеаном (Cherubin d’Orleans) в 1671 году. В действительности, этот прибор был псевдостереоскопической системой, в которой прямое изображение формировалось только при использовании дополнительных линз.

Рис. 1. Первый микроскоп стереоскопического типа

Основной недостаток конструкции д’Орлеана состоял в том, что левая часть изображения проецируется в правый окуляр, и наоборот. Так продолжалось до тех пор, пока 150 годами позднее Чарльз Уитстоун (Charles Wheatstone) написал трактат о бинокулярном зрении, который пробудил серьезный интерес к стереомикроскопии и придал импульс дальнейшим разработкам.

В середине девятнадцатого столетия Фрэнсис Герберт Винэм (Francis Herbert Wenham) из Лондона сконструировал первый действительно удачный стереомикроскоп. Винэм внедрил новаторское решение, применив ахроматическую призму для расщепления светового пучка позади одиночного объектива. Несколькими годами позже Джон Вер Стефенсон (John Ware Stephenson) изготовил аналогичный прибор (см. рисунок 1). Получивший известность бинокулярный микроскоп Винэма имел много дефектов изображения, обусловленных использованием одиночной линзы, и, в действительности, не создавал стереоскопического эффекта.

В начале 90-х годов девятнадцатого века Горацио С. Грену (Horatio S. Greenough), американский приборостроитель представил новаторскую конструкцию, ставшую прародительницей современных стеромикроскопов. Грену убедил компанию «Карл Цейсс» начать выпуск микроскопов его конструкции. Однако, вместо внедрения линзовой оборачивающей системы Грену, для получения прямого изображения инженеры из Йены разработали оборачивающие призмы. Эта конструкция выдержала испытания временем (и огромным количеством микроскопистов), и была «рабочей лошадкой» для биологической и медицинской диссекции на протяжении всего двадцатого столетия. Более того, и сегодня микроскопы этой конструкции являются предпочтительными для многих специальных приложений.

Выпускавшиеся в первой половине двадцатого века стереомикроскопы, или, как их называли, «препаровальные лупы», представляли собой наиболее традиционные составные микроскопы эпохи. Они были тяжеловесными и изготавливались, преимущественно, из латуни. В них использовались простые оптические системы, состоявшие из одного или двух линзовых дублетов. Для формирования прямого изображения использовались призмы. Рабочее расстояние этих микроскопов обратно пропорционально увеличению, и при максимальных значениях увеличения было достаточно малым. Использовались эти микроскопы, главным образом, для диссекции, поскольку промышленные приложения с использованием миниатюрных сборок, требующих применения микроскопов для контроля, были весьма немногочисленны. Даже часовщики в те времена пользовались монокулярными лупами!

Первый современный стереомикроскоп был представлен Американской оптической компанией (США) в 1957 году. Эта новаторская конструкция получила название Cycloptic^® и имела литой алюминиевый корпус, постоянное рабочее расстояние (которое составляло четыре дюйма, и было самым большим для серийно выпускавшихся микроскопов) и встроенный пятиступенчатый механизм изменения увеличения, позволявший изменять увеличение объектива от 0,7x до 2,5x. Кроме того, в микроскопе использовались одноэлементные оборачивающие стеклянные призмы; он оснащался целым рядом принадлежностей, включая штативы, стойки и осветители. Внешне конструкция была выдержана в духе 1950-х годов, с двухцветной серой окраской (см. рисунок 2). Свое название микроскоп получил от одиночного большого центрального объектива, расположенного в нижней части корпуса. Через этот объектив проходит суммарный (левого и правого каналов) световой поток от образца.

Рис. 2. Стереомикроскоп Cycloptic® Американской оптической компании

Впоследствии конструкция Cycloptic получила название общий главный объектив (CMO). В ней используется один большой объектив, который, будучи сфокусированным на образце, формирует изображение в бесконечность. В отличие от большинства ранних конструкций стереомикроскопов, в нижней части конструкции Cycloptic использовалось резьбовое крепление для установки объектива непосредственно под поворотным барабаном с двумя парами афокальных телескопов Галилея. При вращении барабана телескопические линзы использовались в прямой и обратной ориентации (увеличение или уменьшение), обеспечивая четыре различных значения увеличения. Пятое значение увеличения получалось при использовании открытого канала без линз. Система линз Галилея характеризуется малым фокусным расстоянием, очень малым диаметром поля, и редко дает увеличение более 2x или 3x. Двукратная линза Галилея дает увеличение 2x или 1/2x, в зависимости от ориентации, а согласованные пары могут комбинироваться для получения различных значений увеличения. В насадке микроскопа Cycloptic устанавливаются тубусные линзы, оборачивающие призмы и пара окуляров. Этот микроскоп быстро завоевал популярность у первых производителей полупроводниковых приборов, прежде всего, у компании Western Electric.

Два года спустя (в 1959 году), компания Bausch & Lomb представила конкурировавший с моделью Cycloptic стереомикроскоп, обладавший самой современной функцией — непрерывной регулировкой увеличения или трансфокацией. Получивший название StereoZoom^®, этот прибор стал первым стереомикроскопом без оборачивающих призм. Он был создан на основе конструкции Грену, которую мы подробно рассмотрим позже. По форме и размерам этот микроскоп, в основном, был аналогичен модели Cycloptic (рисунок 3), и имел сравнимый с ней диапазон значений увеличения (от 0,7x до 3,0x) при аналогичных рабочих расстояниях. Кроме того, в этом микроскопе было реализовано изобретение Bausch & Lomb — четыре зеркала с лицевой отражающей поверхностью из усовершенствованного алюминиевого покрытия, которые устанавливались в специальные положения для выполнения функций обеих отклоняющих призм и оборачивающих призм Порро. Прямое изображение в стереоскопии весьма удобно и зачастую просто необходимо, поскольку довольно часто в процессе наблюдения микроскописту приходится выполнять интерактивные манипуляции с образцом. Такие операции, как препарирование, микросварка, промышленная сборка или микроинъекции ооцитов удобнее выполнять с образцом, имеющим при наблюдении через окуляры ту же физическую ориентацию, что и на предметном столике микроскопа. Кроме того, естественное, прямое изображение облегчает изучение пространственных соотношений параметров образца.

Помимо меньшей стоимости, в сравнении с призменными микроскопами, модель StereoZoom имеет меньший вес. Базовая система, названная «Power Pod» — «распределительный щит», дополнялась огромным набором вспомогательных линз, осветителей, рукояток и штативов, изготовленных в задающем тенденцию, проверенном на протяжении 40 лет, стиле. Конструкция StereoZoom была немедленно и на длительный срок принята быстро развивающейся полупроводниковой промышленностью. Она доминировала на рынке стереоскопических микроскопов на протяжении многих лет, пока в 2000 году ее выпуск не был прекращен компанией Leica, объединившей в 1980-х годах ресурсы Американской оптической компании, а также компаний Bausch & Lomb, Leitz, Reichert и Wild.

Рис. 3. Микроскоп StereoZoom® компании Bausch & Lomb

В начале 1960-х годов на рынке США начали появляться стереомикроскопы с функцией трансфокации, представленные японскими компаниями Nikon, Olympus, Unitron и другими (менее известными). Совместными усилиями японские, американские и европейские производители стереомикроскопов продолжали совершенствовать свою продукцию, наделяя ее несметным множеством новых функций. Совершенствование стереомикроскопов ускорялось появлением высокоскоростных компьютеров, позволивших оптикам-разработчикам решить сложную задачу создания эффективных оптических систем с переменным увеличением и хорошей коррекцией оптических аберраций.

Конструкции современных стереомикроскопов характеризуются объективами с высокой числовой апертурой, позволяющими получать высококонтрастные изображения с минимумом засветок и геометрических искажений. Окулярные тубусы дают возможность использовать окуляры с высоким выносом глаза, с полем зрения до 26 миллиметров и диоптрийной регулировкой межзрачкового расстояния, что, в свою очередь, позволяет одновременно помещать в фокус изображение и окулярную сетку. Кроме того, многие модели обладают высокой коэффициентом трансфокации (до 12x-15x), что обеспечивает широкий диапазон изменения увеличения (от 2x до 540x) и сокращает потребность в сменных объективах. Внедрение в конструкцию микроскопов эргономических элементов позволяет снизить утомляемость операторов в результате долгих часов работы, а оснащение современных микроскопов все более новыми вспомогательными принадлежностями дает возможность получать изображения таких образцов, наблюдение которых еще несколько лет тому назад было практически невозможным.

В результате совместной работы глаз и мозга человека формируется то, что называют стереоскопическим (бинокулярным) зрением, создающим пространственные трехмерные изображения окружающих предметов. Стереоскопическое зрение возможно благодаря тому, что мозг интерпретирует два несколько отличные друг от друга изображения, поступающие от сетчатки каждого из глаз. Расстояние между зрачками глаз человека составляет, как правило, 64–65 миллиметров, в результате чего один глаз воспринимает объект с несколько иной, отличающейся на несколько градусов, точки, нежели другой. В процессе передачи в мозг оба изображения сливаются, но при этом сохраняется удивительно высокая степень восприятия глубины. Стерео микроскопы дают возможностью воспринимать глубину благодаря передаче двух расположенных под небольшим углом (как правило, от 10 до 12 градусов) изображений, создающих действительно стереоскопический эффект.

Конструкции стереомикроскопов

В некоторых стереомикроскопах изображение образца формируется при помощи двух раздельных сложных оптических систем, каждая из которых состоит из окуляра, объектива и промежуточных линз. В других конструкциях используется один объектив, общий для двух отдельных оптических каналов. Два отдельных изображения, отличающихся углами наблюдения, проецируются на сетчатки глаз наблюдателя, где они возбуждают нервные окончания, в результате чего информация попадает в мозг для последующей обработки. Результатом описанного процесса является единое трехмерное изображение (образца), разрешение которого ограничивается параметрами оптической системы микроскопа и концентрацией нервных окончаний сетчатки, подобно тому, как разрешение фотографического изображения ограничивается размером зерна фотопленки или плотностью ячеек ПЗС-матрицы цифровой камеры.

В общем, стереомикроскопы можно разделить на два основных семейства, каждое из которых обладает определенными преимуществами и недостатками. В самой ранней стереомикроскопической системе, названной по имени ее изобретателя системой Грену, используются два тубуса, которые разнесены на некоторый угол, что и обеспечивает стереоскопический эффект. В более современной конструкции с общим главным объективом (представлена выше) один большой объектив совместно используется парой окулярных тубусов и оптических систем. Регулировка увеличения в микроскопах обоих типов может обеспечиваться либо отдельными линзами,(ступенчатая смена увеличения), либо системой непрерывного изменения увеличения — трансфокации. Ниже рассматриваются преимущества и недостатки обеих конструкций — конструкции Грену и системы с общим главным объективом.

Рис. 4. Сравнение микроскопов конструкций CMO и Грену

Представленная фирмой «Карл Цейсс» на пороге двадцатого столетия конструкция Грену состоит из двух идентичных (и симметричных) оптических систем, каждая из которых, в свою очередь, состоит из отдельного окуляра и объектива, точно выставленных в едином корпусе (рисунок 4). Основным преимуществом этой системы являются высокие числовые апертуры, получающиеся благодаря использованию объективов конструкции, аналогичной той, которая используется в классических сложных микроскопах. В общем случае, нижние части тубусов с тонкими объективами сходятся под некоторым углом, обеспечивающим наилучшую фокусировку лучей в плоскости объекта. Верхние части тубусов проецируют пару изображений в глаза наблюдателя, обычно, через пару стандартных окуляров. Размер, фокусировку, поворот и центровку двух изображений необходимо поддерживать постоянными с очень высокой точностью, с тем, чтобы глаза видели практически одну и ту же картину. Единственное отличие от тождественности изображений состоит в несколько отличающихся углах проецирования изображения на сетчатку. Благодаря углу схождения, который в современных конструкциях, обычно, равен 10 — 12 градусам, левый глаз видит объект с левой стороны, тогда как правый глаз видит тот же самый объект с правой стороны, и в несколько иной перспективе.

Пара оборачивающих призм или система зеркал перевертывает поступающее из объективов увеличенное изображение, и представляет его наблюдателю так, как оно выглядело бы без микроскопа. В некоторых конструкциях встроенные тубусы обеспечивают прямую линию визирования, тогда как в микроскопах других конструкций используются дополнительные призмы, с целью наклона тубусов и предоставления микроскописту более естественной позиции для наблюдения. Поскольку формирующие изображение световые лучи проходят по центру оптической системы, качество изображения симметрично относительно его центра, как и в большинстве сложных микроскопов. Кроме того, благодаря меньшим размерам и осевой симметрии линз, а также слабой зависимости от света, проходящего через периферию объектива, в микроскопах конструкции Грену легче, чем в микроскопах с общим главным объективом, корректировать оптические аберрации.

Искажение в микроскопах конструкции Грену возникает вследствие отклонения каждого тубуса от общей оси. Вследствие этого искажения, известного под названием трапецеидального, левая часть изображения, наблюдаемого правым глазом, кажется несколько меньше правой части этого же изображения; естественно, обратная картина справедлива для изображения, наблюдаемого левым глазом (см. рисунок 5). Трапецеидальное искажение обусловлено тем, что промежуточные изображения, формируемые каждым тубусом, наклонены относительно плоскости образца и расположены под углом друг к другу, вследствие чего только центральные области одновременно находятся в фокусе при одинаковом увеличении. В результате, периферийные области поля зрения фокусируются немного выше или ниже фактической плоскости образца и слегка отличаются по увеличению, хотя глаза, обычно, компенсируют этот эффект и он часто остается незаметным для наблюдателя. Тем не менее, при длительных наблюдениях трапецеидальное искажение может вызвать утомление и перенапряжение зрения.

Небольшие различия в увеличении и фокусировке в пределах поля зрения стереомикроскопов Грену можно было бы заметить на фотографическом или видеоизображении, полученном через один канал прибора, в особенности, при наблюдении плоского и прямолинейного объекта. При микрофотографировании дискретность фокусировки вследствие наклона легко компенсируется наклоном образца или отклонением одного из пучков лучей, с тем, чтобы оптическая ось микроскопа располагалась перпендикулярно продольной плоскости образца. Для минимизации трапецеидального искажения при использовании окулярной сетки, линейная сетка окуляра должна располагаться в вертикальном направлении. Другое решение состоит в нейтрализации сходимости пучка путем наклона образца или микроскопа на пять-шесть градусов.

Конструкции стереомикроскопов с общим главным объективом основываются на преломляющем действии одного объектива большого диаметра, через который происходит наблюдение объекта по обоим каналам — левому и правому. Каждый из этих каналов работает как независимая оптическая система, параллельная другой (поэтому такие микроскопы называют также параллельными; рисунок 4). В системе отсутствуют коллимированные световые пучки между отдельными каналами и объективом (изображение проецируется в бесконечность). Такая пространственная конфигурация гарантирует, что левая и правая оптические оси сходятся в фокальной точке в плоскости образца. Поскольку такая параллельная ориентация осей обычно распространяется и на окуляры — наблюдатель видит левое и правое изображения с небольшой, либо с нулевой конвергенцией (сходимостью). Основное преимущество системы с общим главным объективом состоит в том, что оптическая ось этого объектива перпендикулярна плоскости образца, благодаря чему система свободна от характерного наклона изображения в фокальной плоскости окуляра.

Несмотря на то, что в большинстве случаев на образце имеет место сходимость величиной от 10 до 12 градусов, мозг не участвует в интерпретации не сведенных трехмерных изображений. Это приводит к уникальной аномалии, характерной для стереомикроскопов с общим главным объективом. При наблюдении изображения через микроскопы этого типа центральная область образца выглядит немного приподнятой, из-за чего плоский образец кажется выпуклым. Например, изображение монеты будет выглядеть утолщенным в центре, вследствие чего наблюдателю будет казаться, что если монету перевернуть на плоской поверхности, то она будет раскачиваться из стороны в сторону. Такое искажение называется искажением перспективы, и не является критичным, если только микроскоп не используется для измерения кривизны поверхности или высоты образца (см. рисунок 5). Хотя образцы со сложными или округлыми формами также, в некоторой степени, демонстрируют искажение перспективы, при наблюдении через стереомикроскоп они зачастую представляются неискаженными.

Рис. 5. Искажение перспективы и трапецеидальное искажение

Искажение перспективы иногда называют эффектом куполообразования или глобулярным эффектом; это искажение является результатом комбинации трапецеидального искажения и подушкообразной дисторсии. В качестве примера на рисунке 5 показано, как выглядела бы слегка увеличенная дискообразная плоская монета (в настоящем случае — один американский цент) при наблюдении через стереомикроскоп с сильным искажением перспективы. Оригинал монеты показан вверху и имеет плоскую поверхность. Под оригиналом представлены изображения, одновременно проецируемые микроскопом, соответственно, в левый и правый глаз. Эти изображения демонстрируют асимметричную подушкообразную дисторсию, направленную к центральной оси микроскопа. Результатом проецирования изображений из обоих окуляров на сетчатку глаз и их объединения в мозгу является восприятие куполообразного или шарообразного объекта. В большинстве профессиональных стереомикроскопов исследовательского класса с общим главным объективом от ведущих производителей этот тип искажений практически исключается, но все характерен для некоторых, более дешевых моделей.

В стереомикроскопах с общим главным объективом часто встречается еще один тип искажений, обусловленных появлением в центре каждого изображения небольших внеосевых аберраций, таких, как астигматизм, кома и поперечная хроматическая аберрация. Это происходит потому, что каждый оптический канал принимает световые лучи от смещенной от центра области большого объектива, вместо приема лучей непосредственно от центра, где аберрации (в особенности, внеосевые) в объективах с наилучшей оптической компенсацией минимальны, либо практически отсутствуют. При наблюдении образца обоими глазами этот эффект обычно незаметен, но микрофотографии или снимки, сделанные цифровой камерой, могут иметь асимметричную геометрию в пределах поля зрения.

Как правило, коррекция хроматических аберраций — это трудное и дорогостоящее дело, особенно, учитывая большие размеры и объемы стела, используемого при изготовлении объективов. В некоторых конструкциях стереомикроскопов эта проблема решается за смещения большогоцентрального объектива, и размещения его по оси левого или правого канала. В микроскопах других конструкций имеется возможность замены большого объектива традиционным, скорректированным на бесконечность объективом, который можно использовать для наблюдения и фотографирования образцов при больших увеличениях (и числовых апертурах).

Наиболее значимой конструктивной особенностью и практическим преимуществом стереомикроскопов с общим главным объективом, как и большинства современных микроскопов, является «бесконечная» оптическая система. Между объективом и съемной насадкой/блоком наблюдательных тубусов двухканальной конструкции с параллельными осями существует путь для коллимированного пучка света (бесконечное пространство на рисунке 6). Такая конструкция позволяет легко устанавливать в пространстве между корпусом и насадкой микроскопа дополнительные приспособления, например, светоделители, коаксиальные эпископические осветители, промежуточные тубусы для фото или видеокамер, телескопические тубусы, устройства подъема уровня выноса глаза и передающие тубусы. Дополнительные принадлежности можно устанавливать также и в пространстве между объективом и трансфокатором, хотя на практике это делается редко. Поскольку оптическая система формирует между штативом и насадкой микроскопа параллельный пучок световых лучей, дополнительные принадлежности не вносят существенных аберраций и не приводят к сдвигу наблюдаемых в микроскоп изображений. Такая универсальность недоступна для стереомикроскопов, построенных по принципу Грену.

Рис. 6. Внутренние компоненты и оптическая система микроскопа Nikon SMZ-1500

Определить, какая из двух конструкций стереоскопических микроскопов (с общим главным объективом или Грену) предпочтительнее — это очень трудная задача, поскольку нет общепринятых критериев сравнения характеристик этих двух систем. В общем случае, микроскопы с общим главным объективом обладают большей светосилой, чем микроскопы конструкции Грену, и часто в них достигается более высокая степень коррекции оптических аберраций. В некоторых случаях для проведения наблюдений и выполнения микрофотосъемки лучшими могут оказаться микроскопы с общим главным объективом, тогда как в других ситуациях могут потребоваться характеристики, присущие только микроскопам конструкции Грену. Поэтому, каждый микроскопист должен самостоятельно определить, какая из конструкций будет наиболее подходящей для решения имеющейся задачи, и использовать эту информацию для разработки стратегии исследований с применением стереоскопических микроскопов.

В большинстве случаев, выбор между стереомикроскопами конструкции Грену и с общим главным объективом делается исходя из прикладной задачи, а не на основании превосходства одной конструкции над другой. Микроскопы конструкции Грену обычно используются в качестве «рабочей лошадки» для пайки миниатюрных электронных компонентов, диссекции биологических образцов и аналогичных рутинных задач. Эти микроскопы сравнительно невелики, недороги, очень прочны, просты в эксплуатации и обслуживании. Микроскопы с общим главным объективом обычно используются для решения более сложных задач, требующих высокого разрешения с применением современных дополнительных оптических и осветительных приспособлений. Широкий спектр принадлежностей, имеющихся для этих микроскопов, определяет прочность их позиций в исследовательской сфере. Микроскопы Грену гораздо скорее можно найти на производственных линиях промышленных предприятий, тогда как область применения микроскопов с общим главным объективом ограничивается исследовательскими и опытными лабораториями. Еще одним фактором влияния на выбор является экономичность покупки микроскопов, особенно, в больших количествах. Стереомикроскоп с общим главным объективом может стоить в несколько раз дороже микроскопа Грену. Это обстоятельство может стать решающим фактором для тех производителей, которым требуется от нескольких десятков до нескольких сотен микроскопов. Тем не менее, существуют и исключения. Если микроскоп с общим главным объективом лучше подходит для выполнения работы, то истинная конечная стоимость приобретения может оказаться меньшей.

Увеличение в стереомикроскопии — объективы и окуляры

Общее увеличение стереомикроскопа представляет собой произведение увеличений объектива и окуляра, плюс увеличение, которое вносят все внутренние элементы или внешние дополнительные увеличительные линзовые системы. С годами был разработан ряд независимых методов изменения (повышения или снижения) коэффициента увеличения стереомикроскопов. Объективы (или объектив в конструкции с общим главным объективом) простейших микроскопов неподвижно крепятся в нижней части корпуса, вследствие чего увеличение можно изменять только путем установки окуляров с изменяемым увеличением. Немного более сложные микроскопы оснащаются сменными объективами, что позволяет изменять коэффициенты полного увеличения за счет использования объективов с большей или меньшей силой увеличения, либо за счет сменных окуляров с различным увеличением. Такие модели имеют резьбовое или зажимное крепление объективов, позволяющее сравнительно быстро изменять коэффициент увеличения.

Для изменения коэффициента увеличения, микроскопы среднего уровня оснащаются либо объективом в подвижном корпусе, либо поворотной головкой барабанного типа с несколькими наборами согласованных объективов. Для изменения увеличения микроскопа оператору необходимо просто повернуть головку и установить очередную пару согласованных объективов под тубусами оптических каналов. В свое время микроскопы такой конструкции были весьма популярны, но сегодня выпускаются все реже.

Микроскопы высшего класса оборудуются трансфокаторной системой или поворотной головкой барабанного типа с телескопами Галилея, которые используются для увеличения или уменьшения общей кратности (увеличения) микроскопа. Поворотный барабан работает, как встроенный промежуточный тубус (или элемент), содержащий парные наборы объективов, которые можно, путем вращения барабана, устанавливать в оптическом пути. В большинстве моделей, для фиксации креплений объективов в нужном (юстированном) положении, в качестве «фиксаторов положения» используются неподвижные упоры — click-stops, которые маркируются, с целью уведомления оператора об использовании нового коэффициента увеличения. Обычно, в барабане имеется пара пустых посадочных мест, в которых нет дополнительных объективов (линз). Расположив эти свободные места на оптическом пути, можно использовать комбинацию объектива и окуляра без дополнительного увеличения.

Рис. 7. Конфигурация стереомикроскопа с трансфокатором

Трансфокаторные системы (см. рисунок 7) обеспечивают плавное изменение коэффициента увеличения при помощи вращающейся рукоятки, расположенной на периферии корпуса микроскопа, либо встроенной в корпус. Такая конструкция исключает «гашение» изображения при ступенчатом изменении увеличения с возможной зрительной потерей пространственных соотношений параметров образца. В некоторых ранних работах трансфокаторные системы часто называются панкратическими системами — от греческих слов пан — «любой» и кратос — «сила» (в том числе и оптическая сила увеличения). Коэффициент трансфокации лежит в диапазоне от 4:1 до 15:1, в зависимости от года выпуска, изготовителя и модели микроскопа. В общем случае, трансфокаторная оптическая система состоит минимум из трех групп линз; в каждую из групп входят два (и более) элемента, точно выставленных один относительно другого. Один из элементов неподвижно закреплен в тубусе оптического канала, а два других плавно перемещаются по оптическому каналу вверх и вниз при помощи прецизионных кулачков. Система предназначена для быстрого и плавного изменения коэффициента усиления с сохранением фокусировки микроскопа. За трансфокаторной системой устанавливаются дополнительные линзы, предназначенные для оборачивания и/или выпрямления (формирования неперевернутого) изображения перед его проецированием в окуляры. В некоторых новейших моделях стереомикроскопов используются фиксаторы click-stops, щелчок которых предупреждает микроскописта об успешном выборе того или иного значения увеличения. Это свойство необходимо для калибровки уровня увеличения при заданном значении оптической силы и, зачастую, весьма полезен при выполнении линейных измерений.

Масштабирующие оптические системы (трансфокаторы) первых стереомикроскопов обладали увеличением от 7x до 30x. По мере улучшения оптических характеристик микроскопов этого класса коэффициенты увеличения росли, благодаря чему современные учебные микроскопы обладают коэффициентами трансфокации от 2x до 70x. Коэффициенты трансфокации стереомикроскопов среднего уровня при верхнем пределе увеличения лежат в диапазоне от 250x до 400x, а в высококлассных исследовательских микроскопах коэффициент увеличения трансфокаторной системы может превышать 500x. Такие коэффициенты увеличения дополняются глубиной поля и рабочими расстояниями, намного превышающими аналогичные параметры сложных микроскопов с эквивалентным увеличением. Рабочие расстояния современных стереомикроскопов лежат в диапазоне от 20 до 140 миллиметров, в зависимости от коэффициента увеличения объектива и коэффициента трансфокации. Специальные вспомогательные линзовые насадки позволяют увеличивать рабочее расстояние до 300 миллиметров и более. Диаметры поля зрения современных стереомикроскопов также намного превышают достижимые при помощи сложных микроскопов.

Вспомогательные линзовые насадки можно устанавливать на корпус объектива микроскопа специальной конструкции (см. рисунок 8). В общем случае, линзовые насадки навинчиваются на резьбу, нарезанную в передней части корпуса объектива. Другие варианты крепятся к корпусу объектива зажимным механизмом. Линзовые насадки позволяют увеличивать или уменьшать коэффициент увеличения основного объектива микроскопа.

Линзовые насадки полезны в тех случаях, когда качество изображения не является решающим фактором, поскольку при использовании линзовых насадок невозможно выполнить точную коррекцию аберраций из-за невозможности всякий раз установить дополнительную линзу точно в одно и то же положение. Кроме того, линзовые насадки изменяют рабочее расстояние объектива (расстояние между образцом и передней линзой объектива). Линза, увеличивающая коэффициент увеличения микроскопа, одновременно уменьшает его рабочее расстояние, и наоборот.

Рис. 8 Набор линзовых насадок для стереомикроскопов

Современные стереомикроскопы оснащаются калиброванными широкопольными окулярами с высоким выносом глаза и увеличением от 5x до 30x с шагом порядка 5x. Большинство окуляров можно использовать с очками или без них. Окуляры оснащаются резиновыми наглазниками, защищающими линзы окуляров от контакта со стеклами очков.

Обычно, окуляры имеют диоптрийную настройку, что позволяет одновременно выполнять фокусировку на образце и измерительных сетках. Оправы бинокулярных тубусов (головок) современных микроскопов позволяют перемещать тубусы и, тем самым, изменять межзрачковое расстояние окуляров в диапазоне от 55 до 75 миллиметров. Часто межзрачковое расстояние регулируется путем поворота призм относительно их оптических осей. Поскольку объективы неподвижны относительно призм, такая регулировка не влияет на стереоскопический эффект. Возможность регулировать межзрачковое расстояние снижает утомление во время длительных наблюдений, однако, требует повторной регулировки в случае использования микроскопа несколькими наблюдателями. Следует иметь в виду, что микроскописты, которые носят очки для коррекции близорукости и различий в остроте зрения глаз, должны использовать свои очки и во время работы с микроскопом. Очки, предназначенные для работы вблизи (для коррекции дальнозоркости), на время наблюдения в микроскоп необходимо снимать, поскольку микроскоп формирует изображение на некотором расстоянии.

Поле зрения (сокращенно FOV), находящееся в фокусе при наблюдении образцов через микроскоп, определяется коэффициентом увеличения объектива и размером фиксированной полевой диафрагмы окуляра. Увеличение коэффициента увеличения традиционных и стереоскопических микроскопов, при постоянной диафрагме, уменьшает размеры поля зрения. И, наоборот, при уменьшении коэффициента увеличения, поле зрения увеличивается, также при фиксированных диаметрах диафрагм окуляров. Изменение диаметра отверстия диафрагмы окуляра выполняется в процессе изготовления. При фиксированном коэффициенте увеличения изменение размера диафрагмы в большую сторону увеличивает поле зрения; уменьшение размера диафрагмы, соответственно, уменьшает поле зрения.

Физический диаметр полевой диафрагмы (расположена впереди или позади полевой линзы окуляра) большинства окуляров сложных и стереоскопических микроскопов измеряется в миллиметрах и называется величиной поля, которая часто обозначается аббревиатурой FN. В окулярах с полевой линзой, расположенной под диафрагмой, действительный физический размер полевой диафрагмы и видимый размер оптического поля могут варьироваться. Измерительные и микрофотографические сетки помещаются в плоскость полевой диафрагмы окуляра, с тем, чтобы они были видны в одной оптически сопряженной плоскости с образцом.

Обычно, количественный размер поля зрения определяется делением величины поля, указанной на окулярном тубусе на значение кратности объектива. Кроме того, необходимо также учитывать выставленное значение коэффициента трансфокации, а также все установленные в оптический путь дополнительные приспособления, с коэффициентом увеличения. Однако, увеличение окуляра не включается в расчет, что является довольно распространенной ошибкой, совершаемой новичками в микроскопии. В случае необходимости иметь более широкое поле зрения, следует выбирать окуляры с большей величиной поля. В диапазоне небольших значений коэффициента увеличения, значения поля зрения у стереомикроскопов значительно больше, чем у классических лабораторных сложных микроскопов. При использовании 10-кратного окуляра и объектива с малым коэффициентом увеличения (0,5x) типичный размер поля составляет от 65 до 80 миллиметров (в зависимости от коэффициента трансфокации), что значительно превосходит размер поля (около 40 мм) у сложного микроскопа со сравнимым увеличением. Для полей таких больших размеров требуется высокая степень освещенности, и зачастую бывает трудно обеспечить постоянный уровень освещенности по всему полю зрения.

Разрешающая способность и глубина поля в стереоскопической микроскопии

Разрешающая способность (или разрешение) в стереомикроскопии определяется, как и в любой другой оптической микроскопии, длиной волны освещения и числовой апертурой объектива. Числовая апертура является мерой разрешающей способности объектива, и определяется, как половинная угловая апертура объектива, умноженная на показатель преломления среды визуализации, — в стереомикроскопии это, как правило, воздух. Наименьшее расстояние, различимое между двумя точками образца, получается путем деления длины волны освещения (в микронах) на числовую апертуру, и выражается следующим уравнением (критерий Релея):

Разрешение (d) = 0,61•λ / (n•sin(Ψ)),

где d — наименьшее разрешимое расстояние; λ — длина волны освещения (в стереомикроскопии это комбинация волн с центром около 550 нм); n — показатель преломления среды между объективом и образцом; и Ψ — половинная угловая апертура объектива. Например, стереомикроскоп Nikon SMZ1500, оснащенный апохроматическим объективом с увеличением 1,6x и числовой апертурой 0,21, обеспечивает максимальное разрешение в 1,6 мкм при освещении образца белым светом со средней длиной волны 550 нм. Следует иметь в виду, что разрешение для объектива с увеличением 1,6x рассчитано исходя из предположения, что средой визуализации между образцом и объективом является воздух. Типичные значения коэффициента увеличения линз для общих главных объективов стереомикроскопов лежат в диапазоне от 0,5x до 2.0x, с тремя-четырьмя промежуточными значениями.

В таблице 1 представлены коэффициенты увеличения, рабочие расстояния и числовые апертуры типичных объективов для стереомикроскопов, при переменном увеличении. В прошлом, некоторые из производителей присвоили коэффициентам увеличения своих объективов для стереомикроскопов цветовые коды. В таблице 1 указаны цветовые коды для объективов стереомикроскопов серии Nikon, имеющих цветовую опознавательную маркировку. Отметим, что многие производители не присваивают объективам стереомикроскопов цветовые коды, вследствие чего коды, представленные в таблице 1, предназначены только для привлечения внимания читателей к тому факту, что некоторые объективы могут иметь как такую, так и иную фирменную маркировку.

Таблица 1. Характеристики объективов для стереомикроскопов

Разрешающая способность объектива стереомикроскопа определяется исключительно числовой апертурой этого объектива и не зависит от оптических характеристик окуляра. Замена окуляров с увеличением 10x окулярами с увеличением 20x, или более, не изменяет общую разрешающую способность системы, хотя, зачастую, при использовании более мощных окуляров проявляются некоторые детали образца, которые не были видны при меньшем увеличении. Окуляры с очень большим увеличением (30x и более) могут создавать пустое увеличение, в особенности, когда полное увеличение микроскопа превышает увеличение, обеспечиваемое числовой апертурой объектива. Для измерения и сравнения характеристик микроскопов разрешающая способность часто выражается в парах линий на миллиметр (пл/мм). В случае уже упоминавшегося объектива Nikon 1,6x, разрешение, в оптимальных условиях, составляет 630 пар линий на миллиметр.

Вспомогательные линзовые насадки с увеличением от 0.3x до 2,0x могут изменять рабочее расстояние и разрешающую способность оптической системы стереомикроскопа. В общем случае, изменение разрешающей способности пропорционально коэффициенту увеличения линзовой насадки. Диаметр поля обратно пропорционален коэффициенту увеличения, тогда как, глубина поля обратно пропорциональна квадрату этого коэффициента. Изменение рабочего расстояния также обратно пропорционально коэффициенту увеличения, но его вычисление усложняется нелинейным характером этой зависимости. Помимо всего прочего, в большинстве случаев вспомогательные линзы не оказывают существенного влияния на яркость изображения.

Таблица 2. Числовые апертуры и эквивалентные значения величины поля

Параметры линз, предназначенных для обычной фотографии, оцениваются исходя из значений величины поля (сокращенно f), а не числовой апертуры (таблица 2). Фактически, это два разных значения, но, в действительности, они выражают один и тот же параметр: способность фотографической линзы или объектива микроскопа собирать световые лучи (в пучок). Величина поля легко преобразуется в числовую апертуру (и наоборот); каждый из параметров равен единице, деленной на удвоенное значение другого параметра:

Величина поля (f) = 1 / (2 x NA) и NA = 1 / (2 x f)

В микроскопии числовая апертура равна показателю преломления среды визуализации, умноженному на угловую апертуру объектива. Величина поля рассчитывается путем деления фокусного расстояния оптической системы на диаметр апертуры. Если диаметры апертуры линз с фокусным расстоянием в 50 миллиметров и 100 миллиметров равны, то величина поля у короткофокусной линзы будет в два раза больше, чем у длиннофокусной. В случае одинакового максимального диаметра апертуры обеих линз, размер для 50-миллиметровой линзы равен f/2, а для 100-миллиметровой — f/4.

Диаметр апертуры объектива стереомикроскопа, как и в случае с объективами традиционных сложных микроскопов, величина неизменная. При увеличении или уменьшении коэффициента увеличения микроскопа путем изменения коэффициента трансфокации, соответствующим образом изменяется и фокусное расстояние. С ростом коэффициента увеличения отношение диаметра апертуры к фокусному расстоянию увеличивается, а при уменьшении коэффициента увеличения, соответственно, уменьшается.

Фокусное расстояние стереомикроскопического объектива с увеличением 2,0x в два раза меньше, чем у объектива с увеличением 1,0x, фокусное расстояние которого, в свою очередь, равно половине фокусного расстояния объектива с увеличением 0,5x. Фокусное расстояние объективов с увеличением 0,5x в некоторых стереомикроскопах Nikon серии SMZ (U, 10a, 800 и 1000) равно 200 мм, тогда как фокусное расстояние объективов с увеличением 1,0x равно 100 мм, а у объективов с увеличением 2,0x фокусное расстояние составляет 50 мм. Относительный размер апертуры системы трансфокации (в сравнении с этим же параметром объектива) управляет величиной поля (и числовой апертурой) микроскопа в целом. С целью увеличения числовой апертуры системы в целом, в микроскопах последних моделей, например, SMZ1500, фокусные расстояния объективов уменьшены. Так, фокусное расстояние объектива с увеличением 0,5x, предназначенного для стереомикроскопа SMZ1500, равно 160 миллиметров, а объективы с увеличением 1,0x и 2,0x обладают, соответственно, в два и в четыре раза меньшим фокусным расстоянием.

Некоторые производители выпускают переходные кольца, с тем, чтобы объективы, предназначенные для микроскопа конкретной модели, можно было использовать и со стереомикроскопами других, как правило, более ранних моделей. В некоторых случаях фокусные расстояния объективов с одинаковыми коэффициентами увеличения могут быть разными из-за различия апертур тубусной линзы и трансфокационного канала. Например, фокусное расстояние объектива с увеличением 1,0x для стереомикроскопа Nikon SMZ-U равно 100 мм, тогда как в более поздней модели SMZ1500 используется объектив с фокусным расстоянием 80 миллиметров, с тем же увеличением и оптической коррекцией. Конструктивно два упомянутых микроскопа отличаются размером апертуры трансфокатора, в результате чего у объективов серии SMZ1500 фокусное расстояние меньше. При смене объективов с одинаковым увеличением, но с разными фокусными расстояниями, для вычисления полного увеличения оптической системы необходимо ввести дополнительный коэффициент коррекции разницы фокусных расстояний.

 Таблица 3. Глубина поля объективов стереоскопических микроскопов

В стереомикроскопии глубина поля является очень важным понятием (возможно, даже более важным, чем в других видах классической оптической микроскопии), и сильно зависит от полного увеличения прибора, включая увеличение объектива и вспомогательных линзовых насадок. При увеличении 50x, которое создается объективом с увеличением 1x (числовая апертура 0,10), окулярами с увеличением 10x и коэффициентом трансфокации, равным 5, глубина поля типового стереомикроскопа составляет, приблизительно, 55 микрометров. В случае установки линзовой насадки с увеличением 2x на микроскоп, настроенный на увеличение 50x, новый коэффициент увеличения составит 100x, а глубина поля, при этом, весьма существенно уменьшится, — приблизительно, до 14 мкм, в сравнении 55 микрометрами в варианте без вспомогательной линзы. В этом случае целесообразнее изменить увеличение окуляра с 10x до 20x, что позволит получить дополнительное увеличение и сохранить более значительную глубину поля (см. таблицу 3). Увеличение числовой апертуры объектива за счет улучшения оптической коррекции (например, при замене ахроматического объектива апохроматическим) также приводит к умеренному уменьшению глубины поля.

В таблице 3 представлены значения глубины поля для планапохроматического объектива Nikon с увеличением 1x, в зависимости от коэффициента трансфокации и увеличения окуляра. Из данных таблицы видно, что с увеличением коэффициента трансфокации числовая апертура увеличивается, тогда как глубина поля, с увеличением коэффициентов увеличения окуляра и трансфокации, уменьшается.

Глубину поля можно увеличить уменьшением размера двойной ирисовой диафрагмы, установленной между объективом и окулярами. Эта диафрагма открывается и закрывается при помощи маховичка или рычажка на корпусе микроскопа. В действительности, в стереомикроскопе с общим главным объективом это две диафрагмы — по одной на каждый канал.

Эти диафрагмы предназначены для увеличения глубины поля с одновременным повышением контрастности образца, наблюдаемого через окуляры. В таблице 4 представлены значения глубины поля и изменения числовой апертуры для планапохроматического объектива Nikon 1x, в зависимости от диаметра отверстия диафрагмы при максимальном коэффициенте трансфокации (11,25). По мере линейного уменьшения размера диафрагмы, глубина поля с использованием окуляра с 10-кратным увеличением возрастает с 26 до 89 миллиметров, т. е., приблизительно, на 200%. Одновременно с этим, числовая апертура уменьшается с 0,131 до 0,063, или почти на 100%. Аналогичные эффекты наблюдаются с окулярами большего увеличения.

Таблица 4. Глубина поля и числовая апертура в зависимости от диаметра отверстия ирисовой диафрагмы

Уменьшение отверстия ирисовых диафрагм снижает общую интенсивность света, что ведет к увеличению экспозиции при съемке цифровыми и пленочными фотокамерами. В большинстве случаев оптимальные значения диафрагм определяются экспериментально. По мере медленного закрывания диафрагмы изображение становится более контрастным, поскольку интенсивность освещения медленно уменьшается. Начиная с некоторого диаметра отверстия диафрагмы, зависящего от оптической конфигурации микроскопа, изображение начинает ухудшаться, а на деталях образца проявляется дифракция, причем мельчайшие детали просто исчезают. Наилучшим вариантом настройки является баланс между максимальной детализацией образца и максимальной контрастностью в окулярах, на пленочном или цифровом изображении.