RU EN

Цифровое формирование изображений – возможности микроскопии (IV)

Баланс белого и черного

Статья разъясняет, как можно использовать настройки баланса белого и черного в цифровой камере, с целью регулировки цветового баланса цифровых изображений, полученных при различных условиях освещения в оптической микроскопии.

Участок, выбранный в качестве эталона для настройки баланса белого, должен быть как можно бóльшим, и не окрашенным красителями, выделившимися из образца в заливочную среду. Программное обеспечение для настройки баланса белого во многих системах позволяет выбирать одиночную точку изображения (пиксель), либо бóльшую область, которую можно выделить указателем мыши. Наилучшие результаты, обычно, дает выбор максимально большой области. Гораздо больший разброс результатов может возникнуть в том случае, когда для настройки выбирается одиночная точка, поскольку в общий визуальный эффект белого могут вносить вклад локализованные флуктуирующие комбинации интенсивностей красного, зеленого и синего пикселей. При выборе большой площади происходит усреднение по большому количеству пикселей светочувствительной матрицы, что повышает вероятность достижения приемлемого цветового баланса. После выбора эталонной области запускается процедура настройки баланса белого. При помощи специального алгоритма или таблицы соответствия (LUT) система управления камерой устанавливает соответствующие электронные параметры (например, коэффициент передачи для каждой цветовой составляющей), формирующие код (цветовой тон) нейтрального или белого цвета.

Как уже упоминалось, на цветовой баланс цифрового изображения очень сильно влияет спектр излучения, регистрируемого ПЗС или КМОП фотоприемниками, независимо от того, где такой фотоприемник установлен — в фотокамере, в телескопе, на лазерной скамье или в микроскопе. Чтобы получать приемлемые цветные изображения, соответствующие цветовой температуре источника освещения, в цифровых камерах, где используются такие твердотельные устройства, зачастую, необходим некоторый диапазон настроек баланса. Ниже перечислены некоторые обязательные аспекты успешного достижения цветового баланса.

  • Фотоприемники на ПЗС-структурах чувствительны к инфракрасному излучению, поэтому, надежно получать изображения в видимом диапазоне можно, только отфильтровав длинноволновое ИК-излучение. Некоторые камеры могут оснащаться встроенными элементами блокирования ИК-излучения. В противном случае, необходимо осуществлять дополнительную фильтрацию, чтобы исключить ИК-излучение прежде, чем оно достигнет фотоприемника.
  • В любой конфигурации, используемой для настройки баланса белого, как-то: по участку изображения образца, по пустому предметному стеклу или по эталону для отраженного света (например, по белой поверхности), оптическая система микроскопа должна быть юстирована для соответствующего освещения по Келеру и точно сфокусирована на плоскость образца. Соблюдение этих требований минимизирует проблемы неравномерности освещения или цветовых нарушений в поле зрения, возникающие из-за хроматических аберраций.
  • Обычно, фотоприемник оптимально работает в диапазонах высоких цветовых температур. Поэтому, в случае цифровой визуализации осветители с вольфрамово-галогенными лампами должны работать на верхнем пределе диапазона допустимых напряжений. Все необходимые уменьшения интенсивности освещения следует осуществлять при помощи нейтральных светофильтров, а не путем снижения напряжения питания осветительной лампы. Аналогично, правильный цветовой баланс с цифровыми камерами легче достигается при установке в оптическую систему осветителя цветокорректирующего светофильтра, обычно, использующегося при съемке на цветную фотопленку, сбалансированную для дневного света. Компания Nikon обозначает этот фильтр аббревиатурой NCB (нейтральный цветовой баланс), хотя, другие производители используют для фильтров этого же назначения иные названия.
  • Настройка баланса белого по нейтральной серой области в поле образца может дать более точный результат, нежели выбор в качестве эталона чрезвычайно яркого участка. Полностью «линялые», или находящиеся вне динамического диапазона фотоприемника области, на изображении могут выглядеть белыми в результате перенасыщения одной или нескольких цветовых составляющих (RGB). Компенсация таких участков, за счет подбора коэффициента передачи системой настройки цветового баланса, может давать неточные или невоспроизводимые результаты. Серые участки (нейтральной плотности) формируются, приблизительно, равными по интенсивности сигналами красного, зеленого и синего пикселей фотоприемника (либо отдельными цветными RGB-изображениями). В результате, точный цветовой баланс по нейтральной серой области достигается легче.
  • Цветовой баланс изображений, формирующихся микроскопом, зависит от нескольких параметров. Поэтому, для достижения приемлемых результатов, важно понимать взаимосвязи этих параметров. Настройка параметров экспозиции через интерфейс программы визуализации осуществляется за счет изменения коэффициента усиления контура фотоприемника. Поскольку на настройку баланса белого влияет селективная компенсация коэффициентов усиления RGB-приемников, необходимо, прежде чем настраивать баланс белого, установить максимально точный уровень экспозиции. В том случае, когда после выполнения процедуры настройки баланса белого изменяется время экспонирования, или необходимо произвести иные изменения коэффициента усиления и смещения, рекомендуется повторить настройку баланса белого, поскольку все перечисленные факторы взаимозависимы. Аналогично, изменение настроек компонентов микроскопа, влияющих на характеристики светового потока, как-то: регулировка диафрагмы, смена фильтров и объективов может изменить баланс белого и, с целью получения наиболее точных изображений, потребовать повторного выполнения его настройки.
  • В том случае, когда требуется критический анализ цвета, либо необходимо сравнить два образца из выбранной группы (образцы которой были подготовлены по стандартной методике), важно не выполнять повторную настройку баланса белого на каждом образце. В этом случае, правильнее всего выполнить первоначальную калибровку баланса белого только для освещения (с пустым предметным стеклом микроскопа вместо образца), а затем сделать все необходимые настройки и получить изображение одного образца. Затем, снова установив вместо образца пустое предметное стекло, необходимо повторить процедуру балансировки белого по освещенному полю, никоим образом не изменяя экспозицию и конфигурацию микроскопа. После этого необходимо получить изображения сравниваемых образцов, не изменяя настройку баланса белого, экспозицию и так далее. Во избежание нарушения цветового баланса, необходимые изменения времени экспонирования следует свести к минимуму. Иными словами, ключевую концепцию для приложений такого типа (со сравнением образцов по цвету, в целях испытаний или диагностики) можно сформулировать так: настройка баланса белого только по источнику освещения, и использование этого значения баланса, без изменений, для последующей визуализации всех образцов. Такой метод позволяет провести сравнение с учетом цветового эффекта, который источник освещения оказывает на каждый образец в микроскопе.
  • Некоторые, из использующихся в оптической микроскопии методов освещения и улучшения контраста, создают дополнительные трудности в настройке баланса белого в системе получения изображений. Методы поляризованного света, темного поля и флуоресценции, обычно, дают поля обзора, в которых образец представляется в насыщенном цвете на темном фоне, с немногочисленными белыми областями, либо вовсе без таковых. Для таких ситуаций, когда подходящие области белого или нейтрального серого цвета отсутствуют, в некоторых камерах реализован механизм настройки темного баланса или баланса черного. Этот метод устанавливает минимальное значение отклика фотоприемника и может обеспечить удовлетворительный цветовой баланс.
  • Альтернативная методика получения изображений образцов на темном фоне состоит в настройке баланса белого в освещенном поле без образца. Однако, в случае высоко насыщенных, интенсивно окрашенных образцов, нужная экспозиция может потребовать чрезвычайно яркого освещения, либо сравнительно больших значений коэффициента передачи. Это может ограничить точность настройки баланса белого, если он выполнен по ярко освещенному полю в отсутствие образца. Чтобы система баланса белого смогла оценить освещенность с уровнем яркости, который будет иметь место при получении изображения образца (и при достаточно точном значении экспозиции), на время настройки баланса белого на оптическом пути света можно установить нейтральный светофильтр. Для съемки образца этот светофильтр необходимо удалить. Выбор нейтрального светофильтра, близкого к профилю пропускания образца, требует некоторого экспериментирования.

Манипуляции с балансом белого

Часто возникают ситуации, когда невозможно достичь приемлемого баланса белого, используя стандартную процедуру получения изображений. В таких случаях, иногда можно использовать нестандартные приемы, которые позволяют эффективно «обмануть» функцию баланса белого камеры, и сформировать специфический цветовой баланс, который может считаться, либо не считаться, правильным, однако достигает желаемого эффекта. Когда же и этот метод не обеспечивает приемлемую цветопередачу, либо когда уже имеющееся изображение было изначально получено с неудовлетворительным балансом белого, в некоторой степени исправить ситуацию можно послесъемочной обработкой, при помощи программ редактирования цифровых изображений (например, Adobe Photoshop).

Основной способ «заставить» функцию баланса белого отклониться от нормального режима работы состоит в настройке баланса белого с использованием цвета, отличного от белого. Если камере в качестве белого будет представлен небелый цвет, контур управления коэффициентом усиления фотоприемника будет пытаться сместить выходной сигнал в направлении противоположного (или дополнительного) цвета, чтобы компенсировать небелый оттенок. Фактически, чтобы воспроизвести представленный небелый цвет, как белый, происходит изменение относительной величины красного, зеленого и синего каналов, с одновременным смещением других цветовых составляющих изображения в направлении того же дополнительного цвета. Например, изображение, имеющее красноватый оттенок, который невозможно до приемлемой степени скорректировать при помощи системы управления камерой, зачастую, можно сбалансировать путем калибровки по красному эталону. В попытке воспроизвести красный эталон, как белый, система увеличивает уровни сигналов синего и зеленого пикселей, добавляя, тем самым, дополнительный голубой оттенок, необходимый для компенсации красного. Аналогично, цветовая балансировка по желтому эталону ведет к добавлению синего оттенка в общий цветовой баланс изображения. Чтобы эффективно устранить проблему цветопередачи по этому методу цветовой балансировки, требуется тщательный анализ, с целью определения оттенка, который необходимо добавить или вычесть.

Рис. 1. Принудительная калибровка баланса белого цифровых изображений

На рисунке 1 представлено несколько цифровых изображений образцов, страдающих преобладанием одного из тонов («подцветкой»), из-за маскирования или ошибок препарирования. Показанный на рисунке 1(a) фрагмент интегральной микросхемы (снят в отраженном свете по методу дифференциально-интерференционного контраста), содержит на поверхности пассивирующий слой из нитрида кремния, работающий подобно желтому светофильтру. Прежде, чем достигнуть объектива, отраженные от поверхности кристалла волновые фронты должны пройти через этот слой, при этом, некоторая часть коротковолновых составляющих (синих и зеленых) блокируется. В результате калибровки баланса белого цифровой камеры по точке, указанной желтой стрелкой на рисунке 1(a), желтая «подцветка», создаваемая пассивирующим слоем, в основном устраняется, и получается изображение с превосходным цветовым балансом (рисунок 1(b)). Аналогичным образом можно исправить показанное на рисунке 1(с), чрезмерно окрашенное изображение тонкого среза Tilia (американской липы). Калибровка баланса белого по пикселю, находящемуся в области, указанной желтой стрелкой (см. рисунок 1(с)), позволяет получить изображение с чистым белым фоном и хорошим цветовым насыщением (рисунок 1(d)). В препаратах флуоресцентных образцов несвязанные флуорофоры зачастую могут выделяться в окружающую заливочную среду, создавая эффект «чрезмерного окрашивания», (см. изображение тонкого среза папоротника на рисунке 1(e)). Настройка баланса белого цветной камеры по пикселю контрастно окрашенной детали, (показана желтой стрелкой на рисунке 1(e)), часто ослабляет фоновую флуоресценцию (рисунок 1(f)) на конечном изображении.

Зачастую, для реализации описанных методов в конфигурациях с отраженным светом подходят различные цветные светофильтры. Для этой цели пригодны комплекты фильтров, предназначенные для фотопечати. Такие комплекты содержат линейку фильтров различных плотностей каждого основного цвета, что позволяет создавать любой нужный оттенок. Для микроскопии в отраженном свете требуются соответствующие отражающие цветные эталоны для «небелой» балансировки. Они необязательно должны соответствовать каким-либо цветовым стандартам, а для получения желаемого результата, обычно, необходимо экспериментировать. Может подойти любая окрашенная отражающая поверхность, но желательно иметь широкий выбор оттенков и степеней насыщенности. Идеально подходят для этой цели карточки-образцы цвета красок, имеющиеся в магазинах, торгующих лакокрасочными изделиями, поскольку такие карточки представляют все мыслимые цветовые оттенки. В некоторых случаях, для смещения баланса белого можно использовать определенные участки самого образца.

Принцип манипулирования функцией настройки баланса белого камеры, как в случае использования фильтров для проходящего света, так и для отражающих эталонов (например, карточек-образцов), одинаков: в результате настройки баланса белого по небелому цвету, система управления камерой удаляет цвет эталона и представляет его, как наиболее нейтральный серый тон. В большинстве случаев требуется всего лишь незначительное изменение, поэтому, оттенок и насыщенность эталона, дающего необходимое изменение общего цветового баланса изображения, определяется экспериментально. Настройка баланса по бледно-голубому цвету дает эффект потепления общего тона изображения (смещение в сторону красного цвета). И, наоборот, светло-красный эталонный цвет создает смещение в сторону более холодного цветового баланса (голубоватый общий тон). Коррекция по другим цветам подчиняется такой же общей логике. Настройка баланса белого по любому заданному цвету «вынуждает» систему управления камерой сдвигать цветовой баланс в сторону дополнительного цвета. Следует особо отметить, что описанные нестандартные методы настройки цветового баланса представляют собой потенциальный механизм достижения нужного результата в тех случаях, когда обычные методы не дают такой возможности (по причинам, связанным с конкретным образцом, источником света или устройством формирования изображений). В таких случаях сохраняется возможность получить приемлемые изображения за счет смещения восприятия камерой цветовой палитры образца.

Для первоначального получения изображений предпочтительно использовать стандартную настройку баланса белого. Полученное изображение можно, в некоторой степени, скорректировать при помощи программных средств редактирования. Такая корректировка не должна заменять собой правильную настройку баланса белого камеры, но благоразумно использоваться для устранения неприемлемых отклонений изображения образца. Общее изменение цветового баланса влияет на все области образца. Однако, иногда это — приемлемый компромисс, поскольку небольшие корректировки вызывают сравнительно большие изменения фонового тона, и оказывают меньшее влияние на детали образца, окрашенные более интенсивно.

Изменение цветового баланса изображения при помощи программ редактирования может выполняться различными способами, в зависимости от требуемого уровня контроля. Можно непосредственно изменять соотношения между входными и выходными значениями в каналах красного, зеленого и синего цвета, или же изменять комбинированные RGB сигналы. Детали процедуры послесъемочной коррекции цветового баланса зависят от методики и конкретной программы редактирования. Ниже описаны некоторые методы коррекции изображений при помощи популярного программного пакета Adobe Photoshop, хотя, для этой цели можно использовать любую программу обработки изображений, обладающую аналогичными функциями.

Рис. 2. Настройка баланса белого при помощи функции "Уровни" программы Photoshop

Многие программы для редактирования изображений обладают мощным и гибким набором функций, и обеспечивают высокий уровень управления цветовым балансом, насыщенностью и другими характеристиками. В большинстве случаев, для исправления небольших отклонений достаточно простого изменения цветового баланса, которое можно быстро сделать в окне Levels (Уровни) или Curves (Кривые) меню Image (Рисунок) программы Photoshop. В обоих окнах имеются три значка в виде пипеток, которые можно по отдельности выбирать при помощи компьютерной мыши. После выбора инструмента «пипетка», щелкнув в области изображения кнопкой мыши, можно выбрать код цвета пикселей изображения. Левая и правая пипетки определяют черный и белый цветовые коды изображения, а средняя пипетка управляет кодами средних тонов (градациями серого) изображения. Этот селектор яркости средних тонов обеспечивает наиболее простой метод быстрого устранения проблем цветового баланса.

На рисунке 2 представлены результаты настройки цветового баланса при помощи функции Levels (Уровни) программы Photoshop для нескольких цифровых изображений, полученных при помощи микроскопа. Изображение клеток фибробласта (рисунок 2(a)) было получено в свете вольфрамово-галогенного источника без светофильтра дневного света, вследствие чего все изображение имеет желтоватый оттенок. Использование параметров инструмента настройки средних тонов (пипетки) на области, лишенной клеточной структуры (желтая стрелка на рисунке 2(a)), эффективно удаляет подцветку обрабатываемого изображения (рисунок 2(b)). Настройка пипетки белого уровня позволяет удалить желтый оттенок, создаваемый вольфрамово-галогенным освещением в окрашенном тонком срезе (рисунки 2(с) и 2(d)), а настройка уровня черного ослабляет степень чрезмерной окраски флуоресцентного изображения (рисунки 2(e) и 2(f)). В последнем примере, с целью максимального ослабления нежелательной флуоресценции, инструмент «пипетка» можно использовать для выбора из числа пикселей с различными уровнями красного фона.

Подобно функции Levels (Уровни), функция настройки Curves (Кривые) в программе Photoshop предоставляет простые и непосредственные средства установки значений белого, черного и серого, путем выбора из соответствующей области изображения, и позволяет интерактивно настраивать кривую гамма-распределения изображения. Аналогично описанному ранее способу, функция Levels (Уровни) позволяет настраивать цветовой баланс. Откройте файл редактируемого изображения, затем — окно настроек Curves (Кривые), последовательно выбрав в строке меню пункты Image/Adjust/Curves (Рисунок/Настройки/Кривые). При помощи мыши выберите среднюю кнопку с пипеткой и определите на изображении область, которая будет представлять нейтральный серый тон. Щелчок кнопкой мыши в этой области придаст изображению приблизительно правильный цветовой баланс.

Перед использованием функций Levels (Уровни) или Curves (Кривые) установите флажок в окне Preview (Предварительный просмотр), — при этом все изменения изображения будут незамедлительно отображаться на экране, благодаря чему их можно оперативно оценивать. Последовательно выбирая различные области изображения, как правило, можно отыскать такое значение серого, которое будет давать приемлемый цветовой баланс. В некоторых случаях, когда на изображении отсутствуют подходящий серый или средний тона, превосходный результат могут дать селекторы черного или белого уровней. Порядок их использования аналогичен операции балансировки средних тонов. Прежде, чем выбрать черную или темную область изображения, щелчком кнопки мыши необходимо выбрать кнопку левую кнопку пипетки (отображается наполовину заполненной черными чернилами); выбор правой пипетки дает возможность выполнить баланс по белой области изображения. Обычно, экспериментальным путем можно скорректировать до приемлемого уровня самые различные проявления несбалансированности цвета цифровых изображений.

После настройки цветового баланса, манипулируя характеристиками кривой гамма-распределения, можно отредактировать яркость и контрастность изображения. Область графика в окне Curves (Кривые) позволяет произвольным образом изменять форму кривой при помощи стандартной процедуры перемещения объекта. Общие изменения яркости и контрастности изображения лучше выполнять на объединенной RGB-кривой; это минимально повлияет на уже настроенный цветовой баланс. Однако, кривые гамма-распределения можно редактировать для каждого из каналов (красного, зеленого и синего) в отдельности. Для этого, в ниспадающем меню необходимо выбрать соответствующий канал и, перемещением с помощью мыши, нужным образом изменить форму его кривой. Разумеется, такая настройка отдельных цветовых каналов влияет на соотношение цветовых значений и предлагает иную технику точной настройки и оценки отклонений цветового баланса.

По достижении требуемого цветового баланса, прежде чем закрыть окно функции Curves (Кривые) (или другой функции настройки изображения), сделанные изменения можно сохранить для использования с другими изображениями (например, с полученными в аналогичных условиях). Этот прием может оказаться полезным для применения к серии изображений с похожими дефектами цветового баланса, даже в отсутствие на них подходящих нейтральных или белых областей. Если одно из изображений имеет подходящие для балансировки уровни серого, либо может быть скорректировано путем видоизменения кривой распределения, такая же коррекция, зачастую, пригодна для других аналогичных изображений. Чтобы применить сохраненные исправления, необходимо открыть редактируемое изображение и в окне Curves (Кривые) (или Levels (Уровни)) загрузить сохраненный файл поправок. После применения поправочного коэффициента изображение можно оценить и, при необходимости, дополнительно скорректировать кривую распределения.

Рис. 3. Настройка баланса белого при помощи функции "Кривые" программы Photoshop

На рисунке 3 представлена серия изображений, скорректированных при помощи функции Curves (Кривые) программы Photoshop. Окрашенная человеческая ткань (рисунок 3(a)) имеет желтоватый оттенок, часто появляющийся на образцах, окрашенных эозином и гематоксилином. Для представления правильного цветового баланса изображения (рисунок 3(b)), при помощи пипетки белого уровня выбирается участок фона (желтая стрелка на рисунке 3(a)), (аналогично дидимиевому фильтру и традиционной пленке). Голубоватый тон, присутствующий на фазово-контрастных изображениях, полученных с использованием в оптической системе фильтра дневного света (рисунок 3(с)), можно удалить (рисунок 3(d)), выбрав фоновую область для редактирования кривых при помощи пипетки средних тонов. И, наконец, зеленый фон на изображении скелета радиолярии (рисунок 3(e)) легко удаляется (рисунок 3(f)) при помощи пипетки средних тонов.

Явление под названием аппроксимация насыщенности цвета позволяет человеку мысленно корректировать изменения освещенности, чтобы «заведомо» белый объект воспринимался, как белый. Степень такой адаптации воспроизведения цвета зависит от наличия в поле зрения эталонного источника освещения. В повседневной обстановке, когда человек погружен в доминирующее освещение или окружен им, аккомодация происходит быстро. Например, белый кусочек бумаги в солнечном свете вне помещения выглядит, как белый, и если внести его в помещение и наблюдать в тусклом свете лампы накаливания, — он тоже будет выглядеть белым. Эта подсознательная коррекция происходит, несмотря на тот факт, что в свете лампы накаливания бумага отражает намного больше желтых и красных составляющих спектра. Аккомодация в отношении цветового баланса при просмотре цветных фотографий или телевизионных передач не происходит, обычно, из-за наличия в окружающей среде других, служащих эталонными, источников света. В общем случае, в восприятии физической реальности существует множество возможных вариантов. Понимание факторов влияния на восприятие — важное условие правильного цветового баланса изображений, получаемых в микроскопии

Таким образом, решающим фактором в оценке и настройке цветового баланса является влияние условий просмотра на восприятие цвета. В случае просмотра изображений на мониторе компьютера необходимо тщательно настроить параметры дисплея, как программные, так и аппаратные: яркость, контрастность и т. д. Эти параметры становятся особенно важными в случае использования нескольких компьютеров, когда один из них выделен для установленной на микроскопе цифровой камеры, а другой (другие) используется с принтером или альтернативным устройством (устройствами) вывода. В случае оценки цвета путем сравнения, с использованием различных методов отображения, либо в разных условиях освещенности, необходимо учитывать эти факторы. Например, восприятие цветового баланса при просмотре изображения на мониторе, находящемся в затемненном помещении, может отличаться от восприятия на том же мониторе, установленном в помещении, которое заливает солнечный или яркий флуоресцентный свет. Аналогичным образом, визуальная оценка общих тонов окраски предметных стекол микроскопов, например, в результате выделения красителей в заливочные среды, будет достаточно разной при рассматривании напротив окна и в свете лампы накаливания. В конечном итоге, процесс получения изображений с правильным цветовым балансом в микроскопии состоит из взаимодействующих компонентов, определяющих регистрацию цвета изображения в процессе съемки, равно и то, как этот цвет воспринимается до и после съемки.

В заключение необходимо отметить, что наиболее общая причина непредвиденных искажений цвета в микрофотографии и при цифровом формировании изображений состоит в отсутствии надлежащего баланса цветовой температуры между источником освещения микроскопа и эмульсией пленки или параметрами настройки фотоприемника. Если цветовая температура источника света слишком низка для пленки или параметров фотоприемника, полученные микрофотографии и цифровые изображения будут окрашены в общий желтоватый или красноватый тон и выглядеть теплыми. Если же цветовая температура источника света чрезмерно высока, полученные изображения будут иметь синий тон и выглядеть холодными. Степень цветовых сдвигов определяется величиной несоответствия цветовых температур, а сильные несоответствия влекут экстремальные цветовые отклонения. Идентичные явления происходят и в твердотельных цифровых системах получения изображений. Несмотря на кажущуюся проблематичность, возникающие цветовые искажения всегда легко исправляются правильным использованием соответствующих конверсионных и балансировочных светофильтров, либо за счет точной калибровки баланса белого цифровой фотокамеры.

Требования к разрешающей способности цифровой камеры для оптической микроскопии

Предельная разрешающая способность фотоприемника с зарядовой связью (ПЗС), или комплементарного металл-оксид-полупроводникового (КМОП) фотоприемника, является функцией количества имеющихся в нем фотодиодов и их размеров, относительно изображения, проецируемого оптической системой микроскопа на поверхность матрицы формирования изображений. Используйте эту зависимость для определения минимальной плотности пикселей, необходимой для адекватной регистрации всей оптической информации, поступающей от микроскопа, при согласовании разрешающей способности микроскопа с параметрами конкретной цифровой камерой с видеосоединителем.

Качество изображений, проецируемых оптическим микроскопом на фотодиодную матрицу ПЗС или КМОП-формирователя изображений, зависит от целого ряда факторов, начиная с коэффициента увеличения, числовой апертуры и разрешающей способности объектива и, заканчивая, размерами фотодиодной матрицы электронного формирователя изображений, соотношением сторон, коэффициентом увеличения видеосоединителя и размерами отдельных светочувствительных элементов матрицы. Кроме того, необходимо учитывать параметры конкретного образца, например, контрастность, отношение сигнал/шум, внутрикадровый динамический диапазон и время интегрирования.

Предельная разрешающая способность матрицы ПЗС является функцией количества имеющихся в ней фотодиодов, а также их размера относительно изображения, проецируемого на поверхность матрицы объективом микроскопа. Размеры предлагающихся на рынке матриц ПЗС колеблются от нескольких сотен до многих тысяч пикселей. Современные матрицы, использующиеся в научно-исследовательских приборах, содержат от 1000×1000 до 5000×5000 светочувствительных элементов. Тенденция в производстве бытовых и профессиональных ПЗС-камер состоит в непрерывном уменьшении размеров фотоэлементов, благодаря чему сегодня доступны цифровые камеры с фотодиодами 4×4 микрона.

Для достижения адекватного разрешения образца, визуализируемого оптической системой микроскопа, нужно сделать, минимум, две выборки для каждой разрешимой единицы, хотя, чтобы достичь достаточного разрешения, многие пользователи предпочитают делать три выборки на разрешимую единицу. В ограниченных дифракцией оптических приборах, таких, как микроскопы, предел Аббе для оптического разрешения объектива с числовой апертурой 1,4 на средней длине волны видимого диапазона (550 нанометров), составляет 0,20 мкм. Таким образом, фотодиод площадью 10 квадратных микрометров имеет размер, достаточный для обеспечения необходимого оптического и электронного разрешения, а предпочтительным является фотодиод с размерами 7×7 мкм. Хотя, меньшие фотодиоды в ПЗС-фотоприемнике и улучшают пространственное разрешение, они, при этом, ограничивают динамический диапазон устройства.

Табл. 1. Требования к размерам пикселей для согласования с оптическим разрешением микроскопа

Объектив
(числовая апертура)

Предел
разрешения
(микрометры)

Проецируемый
размер
(микрометры)

Требующийся
размер пикселя
(микрометры)

1x (0,04)

6,9

6,9

3,5

2x (0,06)

4,6

9,2

4,6

2x (0,10)

2,8

5,6

2,8

4x (0,10)

2,8

11,2

5,6

4x (0,12)

2,3

9,2

4,6

4x (0,20)

1,4

5,6

2,8

10x (0,25)

1,1

11,0

5,5

10x (0,30)

0,92

9,2

4,6

10x (0,45)

0,61

6,1

3,0

20x (0,40)

0,69

13,8

6,9

20x (0,50)

0,55

11,0

5,5

20x (0,75)

0,37

7,4

3,7

40x (0,65)

0,42

16,8

8,4

40x (0,75)

0,37

14,8

7,4

40x (0,95)

0,29

11,6

5,8

40x (1,00)

0,28

11,2

5,6

40x (1,30)

0,21

8,4

4,2

60x (0,80)

0,34

20,4

10,2

60x (0,85)

0,32

19,2

9,6

60x (0,95)

0,29

17,4

8,7

60x (1,40)

0,20

12,0

6,0

100x (0,90)

0,31

31,0

15,5

100x (1,25)

0,22

22,0

11,0

100x (1,30)

0,21

21,0

10,5

100x (1,40)

0,20

20,0

10,0

Объектив

Обычно, в микроскопии изображение проецируется оптической системой на поверхность фотоприемника, которым может быть сетчатка человеческого глаза, электрический видеосенсор или светочувствительная эмульсия традиционной фотопленки. С целью оптимизации информационного содержимого конечного изображения, разрешающие способности фотоприемника и микроскопа должны полностью совпадать. Волновой спектр видимого света, использующегося для создания изображения образца, — это один из определяющих факторов разрешающей способности микроскопа. Короткие волны (375–500 нанометров) позволяют различать детали с большей степенью разрешения, чем более длинные (длиннее 500 нанометров). Кроме того, границы пространственного разрешения определяются дифракцией света в оптической системе; обычно, этот параметр называют дифракционно-ограниченной разрешающей способностью. Соотношения между числовой апертурой, длиной волны и оптической разрешающей способностью описываются следующими уравнениями:

r = λ/(2 • NA) (1)
r = 0.61 • λ/NA (2)
r = 1.22 • λ/(NAоб + NAконд) (3)

где r — разрешающая способность (наименьшее различимое расстояние между двумя объектами), NA — числовая апертура объектива, λ- длина волны, NA(об) — числовая апертура объектива, а NA(конд) — числовая апертура конденсора. Уравнения (1) и (2), как можно заметить, различаются множителем, равным 0,5 для уравнения (1) и 0,61 — для уравнения (2). Эти уравнения получены с учетом многих факторов, включая теоретические расчеты в области оптики, с учетом характеристик объективов и конденсоров, но не должны рассматриваться как некий общий физический закон. Предположение, что два точечных источника света могут быть разрешены (визуализированы по отдельности), в том случае, когда центр диска Эйри, формируемого одним из этих источников, перекрывается с отражением первого порядка в дифракционной картине второго диска Эйри, представляет собой условие, известное, как критерий Рэлея. В некоторых случаях, например в конфокальной и многофотонной флуоресцентной микроскопии, разрешающая способность может, в действительности, превышать установленные любым из этих трех уравнений пределы. Другие факторы, такие как низкая контрастность образца и неправильное освещение, могут лишь понизить разрешающую способность, поэтому реальное значение r (около 0,20 мкм при средней длине волны спектра 550 нанометров) и числовая апертура от 1,35 до 1,40 редко достижимы на практике.

При идеальной юстировке микроскопа и соответствии между объективом и конденсором, в уравнения (1) и (2) можно подставить числовую апертуру объектива, при этом, уравнение (3) сведется к уравнению (2). Стоит заметить, что увеличение не входит ни в одно из этих уравнений, поскольку на разрешение образца влияют только числовая апертура и длина волны освещения. Как уже упоминалось (и видно из уравнений), длина волны света является важным фактором, определяющим разрешающую способность микроскопа. Коротковолновое освещение дает более высокое разрешение (меньшие значения r), и наоборот. Наибольшая разрешающая способность в оптической микроскопии достигается при использовании излучения ближней ультрафиолетовой области, на самой короткой из эффективных волн визуализации. По способности различать детали образца за ближним ультрафиолетовым излучением следует голубой, за ним зеленый и, наконец, красный свет. В большинстве случаев, для освещения образца в микроскопии применяется белый свет, излучаемый галогенной лампой с вольфрамовой нитью. Середина видимого спектра приходится на длину волны около 550 нанометров, основную длину волны зеленого света (к этому свету наиболее чувствительны глаза человека). Именно эта длина волны использовалась при расчетах разрешающей способности для учебного пособия и таблицы 1. Немаловажное значение в этих уравнениях имеет и числовая апертура, увеличение которой влечет повышение разрешающей способности (см. таблицу 1).

Отношение сигнала к шуму в приборах с зарядовой связью

Отношение сигнала к шуму (С/Ш) характеризует качество измерений и определяет предельные характеристики любой электронной измерительной системы. В отношении ПЗС-фотоприемника (прибор с зарядовой связью), значение С/Ш представляет собой отношение измеренного уровня светового сигнала к совокупному уровню шума, который состоит из возникающих в электронной системе паразитных компонентов сигнала и, присущих фотонному потоку, естественных флуктуаций. Поскольку ПЗС-фотоприемник аккумулирует заряд дискретных физических элементов, отношение сигнал/шум можно рассматривать, как отношение амплитуды сигнала к погрешности измерения, применительно к каждому пикселю. В ПЗС-системе формирования изображений имеют место три основных вида шумов (помех): фотонный шум, темновой шум и шум чтения. Все эти шумы необходимо учитывать при вычислении отношения сигнал/шум.

При запуске учебного приложения отображается график отношения сигнал/шум в зависимости от времени интегрирования для гипотетической ПЗС-системы, обладающей типичными характеристиками высококачественных камер, использующихся для визуализации в микроскопии. В моделируемой учебным приложением системе можно изменять (при помощи мыши и ползунков, расположенных под рабочим окном), параметры, влияющие на отношение сигнал/шум ПЗС-фотоприемника. При изменении любой переменной, в желтом окне слева происходит обновление расчетного значения отношения сигнал/шум. В процессе формирования изображения электронным фотоприемником, включая ПЗС, случайные флуктуации интенсивности сигнала создают шум, который накладывается на сигнал. С ростом амплитуды шумов возрастает погрешность измерения сигнала. Изменение факторов, непосредственно влияющих на уровень сигнала, оказывает обратное действие на отношение сигнал/шум, чем изменение тех параметров, которые вносят основной вклад в совокупность шумов, что и отражается в индицируемом значении. Высокое отношение сигнал/шум оказывает сильное влияние на получение высококачественных изображений, и особенно критично в приложениях, требующих световых измерений прецизионной точности. Селективные кнопки Binning Factor (Коэффициент бининга) позволяют улучшать отношение сигнал/шум по методу, широко использующемуся в ПЗС-камерахнаучно-исследовательского уровня. При использовании бининга, сформированный сигналом заряд групп смежных пикселей объединяется при считывании в более крупные «суперпиксели». Коэффициент бининга представляет собой количество пикселей, которые объединяются и образуют больший пиксель. При повторном вычислении отношения сигнал/шум, уже с учетом бининга, предполагается, что сигналы всех пикселей группы одинаковы.

Выходной (измеряемый) сигнал ПЗС-системы формирования изображений, который используется для определения отношения сигнал/шум, зависит от падающего на ПЗС фотонного потока (выражается в фотонах за секунду на один пиксель), квантового выхода устройства, (где 1 представляет КПД = 100%) и времени интегрирования (экспонирования; в секундах), в течение которого регистрируется сигнал. Произведение этих трех параметров определяет сигнал (числитель) отношения сигнал/шум, который сравнивается со всеми шумами, суммарный уровень которых является знаменателем упомянутого отношения. Регулятор под названием Quantum Efficiency (Квантовый выход) в окне приложения обеспечивает диапазон регулировки от 20% до 98%; регулятор Photon Flux (Фотонный поток) позволяет задать уровень падающего света в диапазоне от 0,1 до 10000 фотонов в секунду на один пиксель. Регулятор Integration Time (Время интегрирования) задает время интегрирования сигнала ПЗС-устройством в интервале от 0,1 до 100 секунд.

Кроме того, в приложении имеются регуляторы Read Noise (Шум чтения) (среднеквадратичное значение от 2 до 20 электронов на пиксель) и Dark Current (Темновой шум) (от 0,01 до 50 электронов в секунду на один пиксель). Фотонный шум, вносящий свой вклад в общий уровень помех, является функцией уровня сигнала и не представляет собой независимую шумовую переменную, которую можно было бы уменьшить за счет изменения конструкции или принципа работы камеры, но также включается в расчет отношения сигнал/шум. В желтом числовом поле справа (Detected Photons/Pixel (Зарегистрированные фотоны/пиксель)) индицируется суммарное количество сигнальных фотонов, считанное с каждого пикселя матрицы ПЗС за период интегрирования, заданный соответствующим регулятором. Это значение равно произведению фотонного потока, квантового выхода и времени интегрирования. Пять регуляторов, в сочетании с несколькими селективными кнопками, обеспечивают диапазон отношений сигнал/шум, соответствующий большинству рабочих условий, которые могут возникнуть при использовании ПЗС-камер, предназначенных для микросъемки в условиях низкой освещенности. При первой загрузке или после возврата исходных значений учебного приложения ползунки регуляторов по умолчанию устанавливаются в положения, типичные для охлаждаемой ПЗС-камерынаучно-исследовательского класса.

Ниже кратко характеризуются три основные шумовые составляющие сигнала, которые ухудшают рабочие характеристики устройства визуализации за счет уменьшения отношения С/Ш и учитываются при вычислении общего отношения сигнал/шум.

Фотонный шум (иногда называемый дробовым) обусловлен имманентной статистической изменчивостью частоты поступления фотонов, падающих на ПЗС-устройство. Генерируемые полупроводниковым устройством фотоэлектроны формируют сигнал, амплитуда которого возмущается флуктуациями, описываемыми пуассоновским статистическим распределением фотонов, падающих на данный участок ПЗС. Таким образом, фотонный шум, или разброс измерений, равен квадратному корню из амплитуды сигнала.

Темновой шум порождается статистическим непостоянством количества тепловых электронов, образующихся в кремниевой структуре ПЗС. Это количество не зависит от фотонно-индуцированного сигнала, и очень сильно зависит от температуры устройства. Скорость формирования тепловых электронов, при данной температуре ПЗС-устройства, называется темновым током. Подобно фотонному шуму, темновой шум находится в статистической связи с темновым током и, равен квадратному корню из количества тепловых электронов, генерируемых за время экспонирования изображения. Охлаждение ПЗС-устройства резко уменьшает темновой ток. На практике, высококачественные камеры охлаждаются до температуры, при которой темновой ток в пределах типового интервала экспонирования ничтожно мал.

Шум чтения представляет собой комбинацию составляющих системного шума, присущих процессу преобразования носителей заряда в ПЗС-устройстве в сигнал напряжения (с целью квантификации), а также последующей обработки и аналого-цифрового преобразования. Основной вклад в шум чтения вносит находящийся на кристалле предварительный усилитель. Этот шум равномерно добавляется к каждому пикселю изображения. В высококачественных камерах применяются конструктивные усовершенствования, существенно снижающие значение шума чтения.

Отношение сигнал/шум в учебном приложении вычисляется по следующей формуле: С/Ш = PQet / [ PQet + Dt + Nr2 ]½, где P — падающий фотонный поток (фотонов в секунду на пиксель); Q(e) — квантовый выход ПЗС-устройства, t — время интегрирования (секунды), D — сила темнового тока (электронов в секунду на пиксель); N® — шум чтения (среднеквадратичное число электронов на пиксель).

Анализ показывает, что вышеприведенное уравнение представляет собой отношение суммарного сигнала, формируемого за время экспонирования, деленного на совокупный шум, связанный с описанными выше тремя шумовыми составляющими. Эти три составляющие шума не связаны друг с другом, поэтому в знаменатель входят соответствующие значения каждой из составляющих: корень квадратный из сигнала определяет фотонный шум, темновой шум равен квадратному корню из произведения темнового тока и времени интегрирования, а корень квадратный из N® во второй степени соответствует шуму чтения.

Вычисление отношения сигнал/шум по вышеприведенной формуле предполагает, что сигнал обусловлен только одним источником света. Различные паразитные источники фонового освещения, например, рассеяние света в системе формирования изображений, могут вносить свой вклад в результирующий шум. Если такой вклад значителен, то к фотонному шуму необходимо добавить фоновый фотонный поток (B), в соответствии со следующей формулой: С/Ш = PQet / [(P + B)Qet + Dt + Nr2 ]½

Еще один, подлежащий учету фактор, состоит в том, что значения падающего и фонового фотонных потоков, равно как и квантовый выход, являются функциями длины волны. Поэтому, в случае использования источников освещения с широким спектром излучения, вычисление отношения сигнал/шум требует интегрирования этих переменных по всем длинам волн, использующимся для формирования изображения. В высококачественных ПЗС-системах формирования изображений используются различные методы повышения отношения сигнал/шум. Для снижения скорости генерирования в полупроводниковых структурах ПЗС-устройства теплового заряда (который проявляется в виде темнового тока), иногда используются специальные технологии изготовления и режимы использования этих устройств. С целью снижения темнового тока до ничтожно малого уровня общепринято подвергать ПЗС-камеры термоэлектрическому или криогенному охлаждению. В случае необходимости, возможен даже экстремальный метод охлаждения жидким азотом. В общем случае, темновой ток высококачественных ПЗС-фотоприемников уменьшается в два раза при снижении температуры на каждые 5 — 9 градусов Цельсия ниже комнатной. Этот параметр называется «температурой удвоения». Такой темп снижения темнового тока сохраняется до температуры в 5 — 10 градусов ниже нуля. При дальнейшем понижении температуры уменьшение темнового тока быстро ослабевает. Для снижения уровней некоторых составляющих шума чтения, кроме специальных схемных и конструктивных решений, иногда используется техника фильтрации при помощи усовершенствованных интеграторов и методы двойной выборки.

85.jpg

Рис. 4 Зависимость отношения "сигнал/шум" от времени интегрирования

Поскольку фотонный шум является неотъемлемым свойством регистрации сигнала ПЗС-устройства, этот шум невозможно устранить за счет конструктивных решений, и он, по сути, представляет собой «собственный шум» или минимально достижимый уровень шума, относительное влияние которого снижается с увеличением фотонного потока. Поэтому, желательно использовать систему визуализации в условиях, ограниченных только фотонным шумом, сведя все остальные шумовые составляющие к относительно ничтожным значениям. В условиях низкой освещенности (предполагая темновой шум ничтожным благодаря охлаждению), шум чтения превышает фотонный шум; при этом сигнал изображения называется сигналом, ограниченным шумом чтения. Чтобы зарегистрировать больше фотонов и улучшить отношение С/Ш, можно увеличить время экспонирования (интегрирования) камеры, до той точки, когда фотонный шум превысит шум чтения и темновой шум. Сверх этого времени экспонирования изображение называется изображением, ограниченным фотонным шумом.

Ограниченное количество фотонов, имеющихся для формирования изображения, является критическим фактором для многих методов микроскопии. Поэтому, высококачественные камеры конструируются специально для достижения фотонно-ограниченного режима работы при значительно меньших уровнях сигнала, чем обычные камеры, которые, обычно, никогда не достигают этого режима (и достаточно высокого отношения сигнал/шум) при низких уровнях освещенности. В широкопольной микроскопии, где широко используются ПЗС-камеры, колебания амплитуды суммарного сигнала из фокального объема образца могут составлять несколько порядков, и зависеть, главным образом, от используемого метода визуализации и от самого образца. Поток величиной 10e6 (1 миллион) фотонов в секунду из фокального объема, т. е., предельно низкий уровень, эквивалентен распределению 1 фотон в секунду на пиксель по поверхности фотоприемника, имеющего 1 миллион активных пикселей. В качестве сравнения: минимальный предел обнаружения адаптированного к темноте глаза, приблизительно, в 40 раз выше (40 миллионов фотонов в секунду). Высококачественный флуоресцентный микроскоп обеспечивает, обычно, поток от 10e8 до 10e9 фотонов из фокального объема, или от 100 до 1000 фотонов в секунду на пиксель для того же 1-мегапиксельного фотоприемника. Обычный светлопольный режим визуализации обеспечивает, обычно, уровни освещенности (усредненные по всей площади фотоприемника) от 5000 до 40 000 фотонов на пиксель в секунду. Если интервал интегрирования не слишком короток, светлые области широкопольного изображения могут генерировать суммарный регистрируемый сигнал с уровнем более 100 000 фотонов на пиксель.

На рисунке 4 представлен график зависимости отношения сигнал/шум от времени интегрирования (экспонирования) типичной высококачественной ПЗС-камеры, предназначенной для получения изображений при низких уровнях сигнала. Фотонный поток и характеристики фотоприемника фиксированы и указаны на рисунке. На графиках такого типа можно выделить области ограничения сигнала шумом чтения и, соответственно, фотонным шумом. Границей раздела этих областей является время (интервал) экспонирования, начиная с которого фотонный шум превышает шум чтения (для указанных на рисунке параметров фотоприемника и светового потока — около 0,15 секунды). Поскольку фотонный шум и амплитуда сигнала связаны квадратичной зависимостью, граница раздела этих двух областей приходится на время экспонирования, для которого суммарный зарегистрированный сигнал на один пиксель равен, приблизительно, квадрату значения шума чтения. Например, при заданном среднеквадратичном значении шума чтения в 5 электронов на пиксель и существующем фотонном потоке, фотонный шум становится преобладающим при времени экспонирования, достаточном для регистрации более чем 25 фотонов на пиксель. В интерактивном обучающем приложении приводится график, аналогичный представленному на рисунке 4, результирующая кривая которого отражает изменения, вносимые при помощи регуляторов в каждую из регулируемых переменных. Помимо отображаемого слева вычисленного отношения сигнал/шум, в правом желтом окне отображается обновляемое значение Detected Photons/Pixel (Зарегистрированные фотоны/пиксель), а обновляющееся красное текстовое сообщение в верхней части графика указывает, какой шум — чтения или фотонный, является превалирующим для значений, определяемых положениями ползунковых регуляторов. Красная стрелка на кривой указывает текущее заданное время интегрирования. Переход между режимами с двумя разными типами превалирующего шума предполагает ничтожно малый темновой шум, что типично для научно-исследовательского класса ПЗС-систем формирования изображений, хотя возможны и иные ситуации. При определенных условиях, режимы с высокими уровнями темнового тока изменяют значимость относительных значений шума чтения и фотонного шума, в результате чего темновой шум может поглотить как сигнал, так и другие шумовые составляющие.

85.2.jpg

Рис. 5. Улучшение отношения сигнала к шуму посредством бининга

В качестве еще одного механизма повышения отношения сигнал/шум в некоторых ПЗС-камерах научно-исследовательского класса реализована функция бининга пикселей. Следует понимать, что этот метод, в определенной степени, ухудшает пространственное разрешение и, попутно, увеличивает темновой ток. За счет улучшения отношения сигнал/шум матрицы ПЗС, при низких уровнях освещенности и/или при коротких временах экспонирования, система формирования изображений способна достичь режима сигнала, ограниченного фотонным шумом. Для повышения яркости изображения на высоких скоростях передачи кадров, некоторые камеры автоматически используют режим бининга пикселей в процессе предварительного просмотра изображения, что облегчает позиционирование образца и фокусировку. Для демонстрации влияния бининга на вычисленное отношение сигнал/шум, в обучающем приложении имеются селективные кнопки, соответствующие трем коэффициентам бининга. Текст на кнопках означает количество объединяемых функцией бининга пикселей, а именно: 1 пиксель — нет бининга; 4 пикселя — матрица из 2×2 пикселей объединяется в один «суперпиксель»; 16 пикселей — матрица из 4×4 пикселей объединяется в один «суперпиксель». Рисунок 2 иллюстрирует влияние различных значений бининга на поведение кривой зависимости отношения С/Ш от времени экспонирования. Использующееся в обучающем приложении и модифицированное с учетом бининга, уравнение для вычисления отношения С/Ш выглядит следующим образом: С/Ш = MPQet / [ MPQet + MDt + Nr2 ]½.

Символом M в этом модифицированном уравнении обозначено количество объединенных функцией бининга пикселей; предполагается, что сигналы всех этих пикселей одинаковы. Три кривые на рисунке построены для одного ПЗС-устройства с типовыми характеристиками, обозначенными на графике, и для очень низкой интенсивности сигнала от образца (в секунду на один пиксель фотоприемника падает поток из 40 фотонов). Отметим, что для достижения сигнала, ограниченного фотонным шумом, без использования бининга потребовалось бы экспонирование в течение, приблизительно, 4-х секунд. За счет 16-пиксельного бининга, эквивалентное отношение сигнал/шум и общее количество зарегистрированных фотонов на один пиксель достигается, приблизительно, за 0,25 секунды (см. рисунок 5). Это позволяет обновлять просматриваемое изображение с приемлемой 

Почему стоит работать с нами?

Комплексные поставки медицинского оборудования и мед. изделий
Прямые контракты с производителями - поставки оборудования на оптимальных условиях
Устойчивое финансовое положение позволяет участвовать в торгах любого объема
Широкая номенклатура товаров - более 3000 наименований товара на складе
Спонсорская поддержка наших партнеров и агентов
Богатый международный опыт поставок - торговые представительства в 50 странах мира

Связь со специалистом

Запросить цену

Заказать сервис

Отправить резюме

Подписаться на рассылку

Запросить коммерческое предложение