Принципы фазово-контрастной микроскопии (I)

Введение

Фазово-контрастная микроскопия, впервые описанная в 1934 году голландским физиком Фрицем Цернике, является оптическим методом усиления контраста для формирования высококонтрастных изображений прозрачных образцов, таких как живые клетки (обычно в культуре), микроорганизмы, тонкие срезы тканей, литографические рисунки, волокна, дисперсии латексов, фрагменты стекла и субклеточные структуры (включая ядра и другие органеллы).

Рис. 1. Конфигурация фазово-контрастного микроскопа

Суть метода фазового контраста заключается в применении оптического механизма преобразования незначительных изменений в фазе в соответствующие изменения в амплитуде, которые могут быть визуализированы как изменение контраста изображения. Одним из главных преимуществ фазово-контрастной микроскопии является возможность исследовать живые клетки в их естественном состоянии, не убивая их и не прибегая к связыванию или окрашиванию. В результате, динамика происходящих в клетке биологических процессов может наблюдаться и фиксироваться с высоким контрастом и разрешением мельчайших деталей образца.

На рисунке 1 представлены диаграмма прямого фазово-контрастного микроскопа в разрезе и схематическая иллюстрация фазово-контрастной оптической системы. Частично когерентное освещение, производимое галогенной лампы с вольфрамовой нитью, направляется на собирающую линзу и фокусируется на специальном кольце (на рисунке конденсорное кольцо), расположенном в передней фокальной плоскости конденсора. Проходящие через кольцо волновые фронты освещают образец, в котором они либо не испытывают отклонений, либо дифрагируют с запаздыванием по фазе на присутствующих в нём структурах и фазовых градиентах. Неотклонённый и дифрагированный свет, собираемый объективом, разделяется в его задней фокальной плоскости фазовой пластиной и фокусируется в плоскости промежуточного изображения, где и формируется конечное фазово-контрастное изображение, наблюдаемое в окуляр.

До изобретения метода фазового контраста наблюдение в светлопольном проходящем свете было одним из самых распространённых режимов оптической микроскопии, особенно для связанных и окрашенных образцов и других препаратов с высоким естественным поглощением видимого света. Обобщённо, все образцы, хорошо видимые при светлопольном освещении, называются амплитудными объектами (или образцами), поскольку амплитуда или интенсивность освещающего волнового фронта падает при прохождении света через такие образцы.

Оснащение стандартного светлопольного микроскопа вспомогательными оптическими фазово-контрастными приспособлениями может быть использовано для придания большего контраста прозрачным образцам, изображения которых в этом случае напоминают полученные методом оптического окрашивания (см. рисунок 2). Фазовое смещение дифрагированных в образце (называемом фазовым объектом) световых волн методом фазового контраста может быть преобразовано в разницу амплитуд, наблюдаемых в окуляр. Образцы больших размеров также легко наблюдать фазово-контрастным методом благодаря дифракции и рассеянию, происходящих на краях этих объектов. Производительность современных фазово-контрастных микроскопов настолько высока, что позволяет, в сочетании с электронным усилением и последующей обработкой изображения, визуализировать мельчайшие внутренние структуры образцов, иногда состоящие всего из нескольких белковых молекул.

На рисунке 2 сравниваются изображения живых клеток в культуре, полученные при светлопольном и фазово-контрастном освещении. Клетками является глиальная ткань мозга человека, выращенная в монослойной культуре в питательном растворе, содержащем аминокислоты, витамины, минеральные соли и фетальную телячью сыворотку. При светлопольном освещении (рисунок 2(а)) клетки оказываются полупрозрачными, так что различить можно только участки с высоким преломлением, такие как мембраны, ядра и неприкреплённые клетки (круглые или сферические). При наблюдении с применением вспомогательных фазово-контрастных устройств в том же поле зрения обнаруживается значительно больше структурных деталей (рисунок 2(b)). Становятся различимы места прикрепления клеток, и, в значительной степени, внутренняя структура. К тому же, существенно расширен диапазон контрастности.

Рис. 2. Живые клетки в светлопольном освещении и фазовом контрасте

Создание Цернике оптической теории фазового контраста является замечательным примером того, как результаты исследования в высоко специализированной области (в данном случае — теоретической физике) могут послужить толчком к развитию новых направлений в таких, казалось бы, не связанных дисциплинах, как биология и медицина.

В микроскопии, метод фазового контраста был впервые применен во время Второй мировой войны компанией Zeiss Optical Works в городе Иена, Германия. Этот метод, внедрение которого оказало незамедлительное и существенное влияние на биологические исследования, остаётся широко распространённым и сегодня. Современные фазово-контрастные объективы, разработанные и выпускаемые компанией Nikon и другими производителями, могут функционировать в сочетании со вспомогательными методами усиления контраста, такими как дифференциальный интерференционный контраст, флуоресценция и поляризация света. Эти объективы могут поставляться с внутренними фазовыми пластинами, имеющими различную степень поглощения и фазового смещения прямого (недифрагированного) света, что обеспечивает широкий диапазон контраста образца и интенсивности фона в фазово-контрастной микроскопии.

Взаимодействие световых волн с фазовыми образцами

При прохождении через фазовый образец, падающий волновой фронт освещающего пучка света оказывается разделённым на два компонента. Основным компонентом является неотклонённый (недифрагированный или нулевого порядка) плоский волновой фронт, обычно называемый прямой волной (или S-волной), который проходит через образец и вокруг него, не взаимодействуя с ним. Кроме этого, появляется и отклонённый или дифрагированный сферический волновой фронт (D-волна, от английского diffract -дифрагировать), рассеиваемый по широкой дуге (во многих направлениях) и заполняющий всю апертуру объектива. Пройдя плоскость образца, прямая и дифрагированная волны падают на переднюю линзу объектива, которая собирает их в плоскости промежуточного изображения, где они интерферируют, образуя результирующую частичную волну (часто называемую P-волной, от английского particle -частица). Математически, соотношение между различными световыми волнами, генерируемыми в фазово-контрастной микроскопии, может быть представлено просто как:

P = S + D

Формирование изображения образца зависит от относительной разницы интенсивностей, а, следовательно, от амплитуд частичной и прямой (P и S) волн. Если в плоскости промежуточного изображения разница амплитуд частичной и прямой волн существенна, образец приобретает значительную степень контраста и легко визуализируется в окуляре микроскопа. В противном случае, образец остаётся прозрачным, как если бы он наблюдался при обычном светлопольном освещении (без применения фазового контраста или других методов усиления контраста).

Если говорить об оптической разности хода между образцом и окружающей средой, то часть падающего волнового фронта, пересекающая образец (D-волна), но не проходящая через окружающую среду (S-волна), оказывается слегка запаздывающей. Для реализации идеи фазового контраста чрезвычайно важна способность образцов менять длину оптического пути (что, на самом деле, эквивалентно фазовому сдвигу). В классической оптике оптическая длина пути (ОДП) через объект или какой-нибудь участок является произведением показателя преломления (n) и толщины (t) объекта или промежуточной среды, как описано соотношением:

Оптическая длина пути (ОДП) = n • t

При попадании света из одной среды в другую, его скорость меняется пропорционально разности показателей преломления этих двух сред. Таким образом, когда когерентная световая волна, испущенная сфокусированной нитью накала микроскопа, проходит сквозь фазовый образец с показателем преломления (n) и толщиной (t), скорость волны либо возрастает, либо уменьшается. Если показатель преломления образца больше показателя преломления окружающей среды, волна замедляется при прохождении через образец и, следовательно, на выходе из него сдвинута с отставанием по фазе. И наоборот, если показатель преломления среды больше, фаза волны набегает при возбуждении образца. Разность положения выходящего из образца волнового фронта (по отношению к волновому фронту, движущемуся через среду) называется фазовым сдвигом (δ) и определяется в радианах следующим уравнением:

δ = 2ΠΔ/λ

В этом уравнении переменной Δ обозначена оптическая разность хода, которая аналогична оптической длине пути:

Оптическая разность хода (ОРХ) = Δ = (n2 — n1) • t

где n(2) — показатель преломления образца, а n(1) — показатель преломления окружающей среды. Оптическая разность хода является произведением двух величин: толщины образца и разности показателей преломления образца и окружающей среды. Во многих случаях, оптическая разность хода бывает достаточно большой, даже когда толщина образца относительно невелика. С другой стороны, при совпадении показателей преломления образца и среды оптическая разность хода равна нулю независимо от толщины образцов.

Для отдельных клеток в тканевой культуре оптическая разность хода относительно невелика. Толщина обычной клетки в монослойной культуре составляет около 5 микрометров, а её показатель преломления приблизительно равен 1,36. Окружающая клетку питательная среда имеет показатель преломления 1,335, что соответствует оптической разности хода 0,125 микрометра, или около четверти длины волны (зелёного света). Субклеточные структуры дают ещё меньшее запаздывание. Эти небольшие оптические разности хода приводят к линейному падению интенсивности с одновременным нарастанием фазового сдвига (изображение постепенно темнеет) до определённого момента (в зависимости от конфигурации фазовых пластинок), после которого изображение образца становится ярче благодаря обращению контраста. В фазово-контрастной микроскопии соотношение между интенсивностью изображения и оптической разностью хода, генерируемой образцом во всём диапазоне толщины и показателя преломления, не является простой линейной зависимостью. Напротив, интенсивность зависит от множества факторов, включая поглощение на фазовой пластине, степень отставания или опережения фазы на ней и относительный знак этого фазового смещения.

Взаимодействие волн в фазово-контрастной микроскопии

Соотношение фаз прямой, дифрагированной и частичной (S,D и P) волн в плоскости изображения в зоне образца при светлопольном освещении (в отсутствие вспомогательных оптических устройств для фазового контраста) приведено на рисунке 3. Прямая и частичная волна, относительные амплитуды которых определяют контраст образца, представлены красной и зелёной линией (соответственно). Волна, порождённая дифракцией в образце, никогда не наблюдаемая непосредственно, изображена синей линией меньшей амплитуды. Прямая и дифрагированная волны вновь объединяются, интерферируя друг с другом, в результате чего в плоскости изображения микроскопа создается частичная волна. Амплитуда каждой из волн на рисунке 3 представляет собой векторную сумму электрических полей отдельных волн.

Рис. 3. Фазовые соотношения в светлопольной микроскопии

По отношению к прямой волне, дифрагированная волна имеет меньшую амплитуду (поскольку количество дифрагированных фотонов в плоскости изображения гораздо меньше, чем прямых) и благодаря взаимодействию с образцом отстаёт по фазе приблизительно на 90 градусов (четверть длины волны). Небольшое фазовое смещение (на 1/20 длины волны) результирующей частичной волны, возникающее благодаря интерференции дифрагированной и прямой волны, обычно является следствием взаимодействия света с мелкими субклеточными структурами и связано с разницей оптической длины пути. Поскольку амплитуды прямой и частичной волны практически одинаковы, прозрачные образцы полностью лишены контраста и почти невидимы на светлом фоне.

Взаимодействие между отдельными волновыми фронтами в светлопольной и фазово-контрастной микроскопии может быть описано векторным способом в полярной системе координат. В такой системе длина вектора представляет амплитуду отдельной волны, а угол поворота вектора относительно фиксированного направления (угловой фазовый сдвиг) — степень фазового смещения (см. рисунок 3(b)). Векторное представление волнового взаимодействия в фазово-контрастной микроскопии было введено Фрицем Цернике и позже детально разработано Робертом Барером. Хотя этот наглядный способ описания редко используется сегодня, многие исследовательские статьи и научные доклады, опубликованные за последние несколько лет, опираются на представление волнового взаимодействия с помощью векторных диаграмм.

В векторных диаграммах, описывающих фазовый контраст, фазовое запаздывание выражается во вращении по часовой стрелке (относительно произвольного направления), тогда как фазовое опережение — во вращении против часовой стрелки. На рисунке 3(b), который формально является векторной диаграммой, векторная сумма прямого (S) и дифрагированного (D) волновых фронтов даёт частичный(P) волновой фронт. Такой механизм представления взаимодействия волн удобен, поскольку помогает наглядно представить фазовый сдвиг дифрагированной волны, а также влияние этого сдвига на фазу результирующей частичной волны (и наоборот). Фазовый сдвиг дифрагированной волны по отношению к прямой волне на диаграмме 3(b) обозначен через Φ, где:

Φ = ± 90° + φ/2

В этом уравнении φ — относительный фазовый сдвиг (являющийся функцией оптической разности хода) между векторами прямой (S) и частичной (P) волны. Для образцов, демонстрирующих пренебрежимо малую оптическую разность хода (то есть отсутствие фазового сдвига) второе слагаемое уравнения равно нулю, а Φ, соответственно, ± 90 градусов. Как показано на рисунке 3(b), очень низкая амплитуда и малый (или нулевой) фазовый сдвиг дифрагированной (D) волны приводят к тому, что амплитуда частичной волны практически равна амплитуде прямой волны. При одинаковости амплитуд (или интенсивностей) частичной и прямой волн формирования контраста не происходит, и образец остаётся невидимым на светлом фоне.

Фазово-контрастный микроскоп

В основе конструкции фазово-контрастного микроскопа лежит идея разделения прямого и дифрагированного волновых фронтов, выходящих из образца, которые проецируются на разные участки в задней фокальной плоскости объектива (дифракционной плоскости в задней апертуре объектива). К тому же, амплитуда прямого (неотклонённого) света должна быть уменьшена, а её фаза должна быть смещена либо вперёд, либо назад (на четверть длины волны), чтобы максимально увеличить разность между интенсивностью образца и фона в плоскости изображения. Относительное запаздывание по фазе формируется на двух этапах: во-первых, дифрагированные волны отстают по фазе на четверть длины волны по выходе из образца; во-вторых, прямые волны либо набегают (либо отстают) по фазе при прохождении фазовой пластины, расположенной в задней фокальной плоскости объектива или около неё. Для превращения светлопольного микроскопа в фазово-контрастный необходимо всего два специальных вспомогательных устройства. Специальная кольцевая диафрагма в передней фокальной плоскости конденсора, которая соответствует по диаметру и является оптически сопряжённой с внутренней фазовой пластинкой, помещаемой в заднюю фокальную плоскость объектива.

Рис. 4. Оптическая система фазово-контрастного микроскопа

Конденсорное кольцо (изображено на рисунках 1 и 4) обычно представляет собой непрозрачную совершенно чёрную (поглощающую свет) пластину с прозрачным отверстием в виде кольца и располагается в передней фокальной плоскости (апертуре) конденсора с тем, чтобы образец освещался расфокусированным параллельным светом, выходящим из кольца. Изображение кольцевой диафрагмы, создаваемое конденсором микроскопа, проецируется на бесконечность, тогда как объектив проецирует изображение в заднюю фокальную плоскость (где и располагается фазовая пластина, о чём говорится ниже). Необходимо заметить, что во многих работах освещающий поток, выходящий из конденсора фазово-контрастного микроскопа, представляется в виде полого конуса света с тёмным центром. Такое представление удобно с геометрической точки зрения, но не совсем точно. Конденсорное кольцо либо замещает регулируемую ирисовую диафрагму, либо располагается рядом с ней в передней апертуре конденсора. При проведении фазово-контрастных исследований, используя и фазовое кольцо, и апертурную диафрагму, необходимо, чтобы ирисовая диафрагма была раскрыта шире фазового кольца. В отличие от дифференциального интерференционного контраста и модуляционного контраста Хоффмана, круговая геометрия фазово-контрастного освещения и метод регистрации сигнала исключает возникновение артефактов, вызванных анизотропией. Фазовый контраст также не чувствителен к поляризации и двойному лучепреломлению, что является решающим преимуществом при наблюдении живых клеток, выращиваемых в сосудах из пластмассы.

При освещении по Кёлеру прямые световые волны, которые не взаимодействуют с образцом, фокусируются в виде яркого кольца в задней фокальной плоскости объектива (плоскости дифракции). В этих условиях задняя фокальная плоскость объектива сопряжена с передней апертурной плоскостью конденсора; таким образом, недифрагированные (нулевого порядка) световые волны формируют яркое изображение конденсорного кольца в задней апертуре объектива (наложенное на изображение фазовой пластины). Сферический волновой фронт, рассеянный на образце (D-волны), пересекает дифракционную плоскость в различных местах по всей задней апертуре объектива. Распределение (количество и координаты) дифрагированного света зависит от числа, размера светорассеивающих частиц и скачка показателя преломления на них. Большинство образцов рассеивает только малую долю падающих на них световых волн, а остальной свет проходит, не отклоняясь, и равномерно освещает всю плоскость изображения.

И напротив, лишь малая часть прямого плоского волнового фронта попадает в заднюю апертуру объектива, которая соответствует форме сопряжённого конденсорного кольца. Таким образом, два волновых фронта перекрываются незначительно и проходят через разные участки задней фокальной плоскости объектива. Поскольку прямой (нулевого порядка) и дифрагированный свет пространственно разделены в плоскости дифракции, фазой каждого из них (прямого (S) или дифрагированного (D)) можно манипулировать независимо от другого.

Фазовая пластина помещается в заднюю фокальную плоскость объектива или около неё (см. рисунки 4 и 5) для того, чтобы можно было независимо (от дифрагированного света) менять фазу и амплитуду прямого (неотклонённого) света, прошедшего через образец. В некоторых фазово-контрастных объективах на фазовой пластине вытравлена кольцевая канавка, которая благодаря уменьшению толщины стекла смещает фазу прямой (S) волны вперёд на четверть её длины. Часто, кольцо покрыто частично поглощающей металлической плёнкой для уменьшения амплитуды прямого света на 60–90 процентов. Поскольку задняя фокальная плоскость часто находится рядом с какой-либо внутренней линзой, в некоторых фазово-контрастных объективах канавка вытравляется прямо на поверхности линзы. Независимо от способа производства главной особенностью любого фазово-контрастного объектива является наличие в нём фазовой пластины, которая отсутствует во всех остальных микроскопических объективах.

Поскольку частичная волна является исключительно результатом интерференции прямого и дифрагированного волновых фронтов, они, интерферируя в плоскости изображения, дают частичную (P) волну, по амплитуде значительно меньшую прямой волны по сравнению с тем, когда применяемое покрытие имеет нейтральную оптическую плотность. Конечной целью является преобразование относительной разности фаз, вносимой образцом, в разницу амплитуд (интенсивностей) световых волн, выходящих из плоскости изображения. Поскольку глаз человека воспринимает разницу интенсивностей как контраст, образец становится видимым в окуляр микроскопа, на фотографической плёнке в обычной камере и в цифровых ПЗС и КМОП-приборах. Все системы позитивного фазового контраста избирательно смещают вперёд фазу плоского прямого (S) волнового фронта по отношению к сферическому дифрагированному (D). При негативном фазовом контрасте, наоборот, прямой волновой фронт запаздывает по отношению к световым волнам, рассеянным в образце.

В общем, изображения образцов с более высоким в сравнении с окружающей средой показателем преломления оказываются тёмными на нейтральном сером фоне, тогда как изображения образцов с менее высоким по отношению к среде показателем преломления ярче серого фона. Тем не менее, это не всегда так, поскольку специальные фазово-контрастные объективы с более высокими нейтральными плотностями в сочетании с меньшей задержкой фазы (на одну восьмую длины волны или меньше) могут инвертировать контраст в толстых образцах. В итоге, участки с очень большой оптической разностью хода становятся яркими.

Для изменения фазы и амплитуды пространственно разделённых прямого и дифрагированного волновых фронтов в фазово-контрастных оптических системах были разработаны фазовые пластины различных конфигураций. Поскольку фазовая пластина располагается в задней фокальной плоскости объектива (плоскость дифракции) или рядом с ней, весь свет, идущий через микроскоп должен пройти и через этот компонент. Участок фазовой пластины, на котором фокусируется конденсорное кольцо, называется сопряжённой областью, тогда как остальную её часть принято называть дополнительной областью. Сопряжённая область содержит материалы, отвечающие за смещение фазы прямого (недифрагированного) света на 90 градусов вперёд или назад по отношению к фазе дифрагированного волнового фронта. Обычно сопряжённая область фазовой пластины шире (примерно на 25 процентов) изображения конденсорного кольца, для минимизации количества прямого света, попадающего в дополнительную область.

Рис. 5. Апертуры объектива и фазово-контрастная оптика

Серия стандартных фазово-контрастных объективов с возрастающим увеличением и соответствующими конденсорными кольцами представлена на рисунке 5. Как правило, с ростом числовой апертуры и увеличения объектива ширина и диаметр фазовой пластины падают. Размер конденсорного кольца, наоборот, растёт с увеличением объектива. Изображения фазовых пластин в разрезе, также представленные на рисунке 5, помогают понять основные различия между позитивными и негативными фазовыми пластинами. Позитивная фазовая пластина создаёт тёмный контраст, а частично поглощающая плёнка, нанесённая на неё, предназначена для уменьшения амплитуды прямой волны. Помимо этого, в состав такой пластины входит задерживающий фазу материал, предназначенный для смещения фазы дифрагированного света на 90 градусов назад. В состав негативной фазовой пластины также входит и задерживающий фазу, и частично поглощающий материалы. Тем не менее, в ней оба эти материала проложены таким образом, что воздействию (ослаблению и задержке фазы на 90 градусов) подвержена лишь недифрагированная прямая волна.

Большинство доступных сегодня фазовых пластин производятся методом вакуумного напыления тонких диэлектрических и металлических покрытий (плёнок) на стеклянные пластины или непосредственно на поверхность одной из линз объектива микроскопа. Назначение тонкой диэлектрической плёнки состоит в сдвиге фазы, тогда как металлическая плёнка ослабляет интенсивность недифрагированного света. Некоторые производители дополнительно к этим тонким плёнкам применяют различные просветляющие покрытия для сокращения бликов и постороннего рассеянного света, отражающегося обратно в оптическую систему. Если фазовое кольцо не нанесено на поверхность какой-либо линзы, то фазовая пластина обычно вклеивается между двумя линзами, расположенными рядом с задней фокальной плоскости объектива. Толщина и показатели преломления диэлектрического, металлического и просветляющего покрытий, а также прозрачного клея тщательно подбираются для обеспечения необходимого фазового сдвига между дополнительной и сопряжённой областью фазовой пластины. В оптической терминологии фазовые пластины, меняющие фазу прямого света по отношению к дифрагированному на 90 градусов (либо вперёд, либо назад), называются четвертьволновыми пластинами из-за их влияния на оптическую разность хода.

Контраст модулируется изменением свойств фазовой пластины, включая степень поглощения металлической плёнки (или просветляющих покрытий), показатель преломления смещающего фазу материала и толщину фазовой пластины. Некоторые производители микроскопов предлагают целую серию фазово-контрастных объективов с постепенно меняющейся степенью контраста. Например, в линейку Nikon входит пять типов фазово-контрастных объективов. Объективы серии DL (Тёмные) дают темное изображение на светло-сером фоне. Эти объективы предназначены для формирования позитивного контраста образцов со значительной разницей в показателе преломления по отношению к окружающей среде, таких как клетки тканевой культуры. Объективы чуть менее сильного контраста серии DLL (Тёмно-серые), при светлопольном освещении формируют лучшие изображения, чем DL объективы, и применяются в качестве универсальных объективов для комбинированных наблюдений во флуоресцентном, светлопольном, темнопольном режимах и режиме дифференциального интерференционного контраста.

Компанией Nikon также производятся аподизированные фазово-контрастные объективы, имеющие вторичные кольца нейтральной плотности по обе стороны от фазового кольца, которые предназначены для уменьшения «гало» эффектов. Образцы, дающие очень малое фазовое смещение, являются идеальными для наблюдения с помощью позитивных фазово-контрастных объективов серии DM (Серые), формирующих тёмное изображение на средне-сером фоне. Для негативного фазового контраста Nikon предлагает объективы серии BM (Светло-серые), разработанные специально для визуального изучения бактериальных жгутиков, протозоа, волокон фибрина, мельчайших шариков и клеток крови. Объективы светло-серого фазового контраста дают светлые изображения на среднем сером фоне.

В большинстве случаев простого набегания относительной фазы прямого волнового фронта недостаточно для формирования высоко контрастных микроскопических изображений. Это происходит потому, что амплитуда прямых волн существенно больше амплитуды дифрагированных волн, и изображения, формируемые в результате интерференции лишь малой доли общего количества волн, едва различимы. Для уменьшения амплитуды прямого волнового фронта до значений, сравнимых с амплитудой дифрагированной волны (и усиления интерференции в плоскости изображения), увеличивается непрозрачность фазовой пластины объектива нанесением на неё полупрозрачного металлического покрытия нейтральной оптической плотности. Амплитуда прямых световых волн, которые благодаря конструкции фазово-контрастного микроскопа проходят почти исключительно через фазовую пластину, понижается непрозрачным покрытием этой пластины до 10 — 30 процентов от начального значения.

Типы фазовых пластинок, взаимодействие волн и векторные диаграммы, связанные с формированием позитивных и негативных фазово-контрастных изображений представлены на рисунке 6. В дополнение, приведены изображения образцов, полученные этими методами. Как уже говорилось выше, фаза сферического волнового фронта дифрагированного света, выходящего из образца, запаздывает на четверть длины волны по отношению к фазе плоского прямого (или недифрагированного) волнового фронта. В оптической конфигурации, обеспечивающей позитивный фазовый контраст (верхний ряд на рисунке 6), прямой (S) волновой фронт при прохождении фазовой пластины смещается по фазе вперёд на четверть длины волны, чтобы итоговый фазовый сдвиг был 180 градусов (половина длины волны). Таким образом, набежавший прямой волновой фронт теперь может участвовать в ослабляющей интерференции с дифрагированными (D) волнами в плоскости промежуточного изображения.

Рис. 6. Позитивная и негативная фазово-контрастные системы

Позитивный фазовый контраст представлен в верхнем ряду рисунка 6. Фазовая пластина позитивного контраста (слева) смещает прямую волну вперёд на четверть длины благодаря вытравленному на её стекле кольцу, которое физически уменьшает путь, проходимый волной через среду (пластину) с высоким показателем преломления. А, поскольку дифрагированные в образце волны (D-волны) при взаимодействии с кольцом тоже отстали на четверть длины волны, оптическая разность хода между прямыми и дифрагированными волнами по прохождении фазовой пластины составит половину длины волны. В результате, оптическая разность хода между прямыми и дифрагированными волнами оказывается равной 180 градусам, что для образцов с высоким показателем преломления приводит к ослабляющей интерференции в плоскости изображения. Амплитудные кривые деструктивно интерферирующих волн для позитивного фазового контраста изображены на верхнем графике рисунка 6. Результирующая частичная (P) волна по амплитуде меньше прямой (S) волны, в результате чего объект оказывается темнее фона, что иллюстрируется изображением зелёной водоросли Zygnema справа (обозначенным надписью POS). Векторная диаграмма, на которой четвертьволновое опережение прямой волны при позитивном фазовом контрасте представлено поворотом её вектора на 90 градусов против часовой стрелки, расположена на рисунке 6 между графиком и изображением.

Возможны и такие конструкции оптических систем микроскопов, при которых формируемый фазовый контраст будет негативным, как показано в нижней части рисунка 6. В этом случае прямая (S) волна не опережает, а отстаёт от дифрагированной (D) волны на четверть длины. В результате, образцы с высоким показателем преломления оказываются ярче тёмно-серого фона, на котором они представлены (см. изображение с надписью NEG в нижней части рисунка 6). В негативном фазовом контрасте на фазовую пластину объектива нанесено кольцо определённой толщины, сдвигающее фазу прямой (нулевого порядка) волны назад (а не вперёд, как в позитивном фазовом контрасте) на четверть длины волны по отношению к дифрагированной волне. Поскольку при прохождении образца дифрагированная волна тоже отстала на четверть своей длины, оптическая разность хода между прямыми и дифрагированными волнами исчезает, и для образцов с высоким показателем преломления в плоскости изображения имеет место усиливающая интерференция. Следует обратить внимание на то, что в негативном фазовом контрасте результирующая частичная (P) волна по амплитуде больше прямой (S) волны (см. нижний график на рисунке 6). На представленной там же векторной диаграмме негативного фазового контраста вектор прямой волны повёрнут на 90 градусов по часовой стрелке.

Важно заметить, что дифракционная картина, формируемая в задней фокальной плоскости объектива, является Фурье-преобразованием всех пространственных частот, отклонённых и рассеянных образцом в фазово-контрастном и всех других режимах оптической микроскопии. Следовательно, изображение, создаваемое в плоскости промежуточного изображения и конечное изображение, наблюдаемое в окуляр (или регистрируемое фотоприёмником), представляет собой обратное Фурье-преобразование дифракционной картины, формируемой в задней фокальной плоскости объектива и плоскости выноса глаза (переменной плоскости над передней линзой окуляра), соответственно. В фазово-контрастной микроскопии эти свойства оптической сопряжённости используются для усиления контраста изображения, когда путём изменения апертурной функции микроскопа вводится пространственная фильтрация визуальной информации, поступающей от образца. Расположение фазовой пластины (фильтра) в задней дифракционной плоскости объектива позволяет преобразовать изменения фазы в образце в изменения интенсивности, которые можно наблюдать в конечном изображении.

Интерпретация фазово-контрастных изображений

Изображения, формируемые в фазово-контрастной микроскопии относительно легко интерпретировать, когда образец небольшой толщины равномерно распределён по субстрату (как, например, живые клетки, выращенные в монослойной тканевой культуре). При наблюдении тонких образцов с помощью позитивной фазово-контрастной оптики, чаще всего выпускаемой большинством производителей, они оказываются темнее окружающей их среды, если показатель преломления образца превышает показатель преломления среды. Фазово-контрастная оптика дифференцированно усиливает контраст вдоль границ протяжённых образцов, таких, как клеточная мембрана, отделяющая клетку от окружающей её питательной среды, и в итоге формирует высококонтрастные изображения, которые в первом приближении представляют собой карту распределения плотности. Поскольку амплитуда и интенсивность изображения в фазовом контрасте связана с показателем преломления и оптической длиной пути, по оптической плотности можно приблизительно составить картину взаимосвязи различных структур. На самом деле, внутриклеточные органеллы с возрастающей плотностью, такие, как вакуоли, цитоплазма, покоящееся ядро и ядрышки (или митотические хромосомы), обычно визуализируются как ряд всё более тёмных объектов по отношению к фиксированному уровню (такому, как фон). Необходимо также заметить, что в фазово-контрастных изображениях присутствуют многочисленные оптические артефакты, а большие по размеру образцы часто демонстрируют значительные колебания контраста и яркости. Важным фактором в определении того, как формируется изображение и больших, и мелких образцов в фазово-контрастном микроскопе, может быть симметрия.

Точная интерпретация фазово-контрастных изображений требует их пристального рассмотрения и изучения, чтобы артефакты не были ошибочно приписаны важным структурным характеристикам. Например, показатель преломления некоторых внутриклеточных органелл и компонентов часто ниже окружающей их цитоплазмы, тогда как другие имеют более высокий показатель преломления. Из-за изменений показателя преломления, демонстрируемых многочисленными внутриклеточными структурами, внутреннее пространство живых клеток при наблюдении в фазово-контрастный микроскоп может представлять собой шкалу интенсивностей от очень низких до очень высоких значений. Например, пиноцитозные пузырьки, липидные капельки и воздушные вакуоли, присутствующие в растениях и простейших одноклеточных, имеют меньший, по сравнению с цитоплазмой показатель преломления, и поэтому оказываются ярче остальных компонентов. И напротив, как уже говорилось выше, органеллы с более высоким показателем преломления (ядра, рибосомы, митохондрии и ядрышки) оказываются тёмными. Если вызванное образцом запаздывание фазы достаточно велико (фазовый сдвиг дифрагированной волны около половины её длины), интерференция дифрагированных и прямых волн становится усиливающей, благодаря чему эти образцы оказываются ярче окружающего их фона.

Во избежание путаницы между позитивным и негативным контрастом в фазово-контрастных изображениях, необходимо учитывать, какой окажется оптическая разность хода при подготовке того или иного образца. Как говорилось выше, оптическая разность хода является произведением показателя преломления и толщины образца (объекта) и связана с относительным фазовым сдвигом между волнами образца (дифрагированными) и фона (прямыми). Различить компоненты с высоким и низким показателем преломления в фазово-контрастном изображении невозможно без информации об их относительной толщине. Например, мелкий образец с высоким показателем преломления может демонстрировать ту же оптическую разность хода, что и больший по размеру образец с меньшим показателем преломления. При наблюдении таких образцов в фазово-контрастной оптической системе их яркость будет примерно одинаковой. Во многих биологических экспериментах условия, вызывающие сморщивание и набухание клеток, могут приводить к существенным колебаниям контраста. Изменения в контрасте изображения образца могут быть, также, следствием замены внешней среды на другую с большим или меньшим показателем преломления. В действительности, влияние на контраст изображения изменений показателя преломления окружающей среды составляет основу метода, известного как иммерсионная рефрактометрия.

Рис. 7. Образцы в позитивном и негативном фазовом контрасте

На рисунке 7 представлены несколько полупрозрачных образцов, визуализированных как позитивными, так и негативными фазово-контрастными оптическими системами. На рисунках 7(a) и 7(b) показана ктеноидная чешуя рыбы в позитивном фазовом контрасте (рисунок 7(a)) и негативном фазовом контрасте (рисунок 7(b)) при относительно большом увеличении (200x). Такие чешуйки встречаются у большинства костистых рыб (называемых Teleostei). Передняя часть каждой такой чешуйки обычно скрыта под задней частью чешуйки, находящейся впереди. С ростом рыбы, растут и чешуйки, приводя к образованию колец роста, которые, увеличиваясь численно с размером чешуйки, напоминают годичные кольца спиленого дерева. Иногда, картина роста ктеноидной чешуи используется для оценки возраста рыбы. В позитивном фазовом контрасте кольца роста оказываются тёмными на фоне светло-серого гало (рисунок 7(а)), а в негативном фазовом контрасте они гораздо светлее и окружены тёмными бороздками (рисунок 7(b)).

Культура живых клеток яичника китайского хомяка оказывается прозрачной в режиме светлопольного освещения, будучи погружённой в среду для выращивания с показателем преломления очень близким к показателю преломления самой питательной среды. В позитивном фазовом контрасте (рисунок 7©) внутриклеточные структуры, включая ядро и органеллы, могут быть легко визуализированы. Однако, при наблюдении клеток в негативном фазовом контрасте, их границы становятся трудно различимыми, а внутриклеточные структуры — довольно сильно затемнены, за исключением органелл с высоким показателем преломления, которые оказываются очень яркими (рисунок 7(d)). И, наконец, в позитивном фазовом контрасте (рисунок 7(e)) эритроциты человека оказываются тёмно-серыми сплющенными эллипсоидами, напоминающими по форме пончики со светлыми центрами (рисунок 7(f)), тогда как в негативном фазовом контрасте они резко выделяются на тёмном фоне.

Для фазово-контрастных изображений весьма характерны эффекты гало и перехода контраста, когда наблюдаемая интенсивность не соответствует оптической разности хода (значениям показателя преломления и толщины) между образцом и окружающей средой. Хотя эти эффекты естественным образом порождаются фазово-контрастными оптическими системами, их часто относят к артефактам или искажениям изображения, вызванными фазовым сдвигом. Во всех видах позитивного фазового контраста граница между большими по размеру образцами и средой, как правило, окружена ярким фазовым (вызванным фазовым сдвигом) гало. Те же самые гало в оптических системах негативного фазового контраста, наоборот, оказываются темнее образца. Эти эффекты ещё более усугубляются флуктуациями оптической разности хода, в результате которых светлые гало в позитивном фазовом контрасте могут стать тёмными, а тёмные гало в негативном фазовом контрасте — светлыми.

Гало в фазово-контрастной микроскопии возникают потому, что задерживающее фазу кольцо (нейтральной плотности) на фазовой пластине объектива кроме прямых волн пропускает ещё и небольшую часть волн, дифрагированных в образце. Проблема усложняется ещё и тем, что ширина прямого (нулевого порядка) волнового фронта, проецируемого конденсорным кольцом на фазовую пластину, меньше фактической ширины самого фазового кольца. Разница в ширине между кольцом фазовой пластины и прямым волновым фронтом обычно составляет от 25 до 40 процентов и является необходимым следствием ограничений и требований, накладываемых оптической конструкцией прибора. Благодаря расположению меняющего фазу кольца в дифракционной плоскости объектива, через него проходят лишь те дифрагированные в образце волновые фронты, которые соответствуют низким пространственным частотам. Таким образом, дифрагированные в образце волны, проходя через фазовую пластину, сохраняют 90-градусное (четверть длины волны) отставание по фазе по отношению к свету нулевого порядка (неотклонённого или прямого). Возникновение фазово-контрастного гало вызвано затуханием сигналов низкой пространственной частоты, рассеянных в образце под очень малым углом по отношению к прямым волнам нулевого порядка. В результате, отсутствие ослабляющей интерференции между рассеянными в образце волновыми фронтами низких пространственных частот и неотклонёнными волнами приводит к локальным обращениям контраста, проявляющимся в окружающих образец гало. Чтобы добиться резкости границ, в конечном изображении должны быть представлены все пространственные частоты дифрагированных в образце волн.

Фазово-контрастные гало особенно заметны и отчётливы вокруг больших (с низкой пространственной частотой) объектов, таких как ядра, диатомы и целые клетки. Другим фактором, способствующим появлению гало, является перераспределение энергии света в плоскости изображения от участков от ослабления к участкам усиления интерференции. Большие, высококонтрастные гало могут приводить к тому, что изображения образцов, создающих большую оптическую разность хода (эритроциты, плесневые грибы, протозоа, дрожжевые клетки, бактерии и т. д.) будут сливаться. С другой стороны, эффекты гало часто подчёркивают контраст образца с окружающим фоном и во многих случаях приводят к усилению видимости тонких краёв и деталей на границах многих образцов. Этот эффект особенно полезен в негативном фазовом контрасте, в котором вокруг низкочастотных деталей изображения образуются тёмные гало. Часто возможно уменьшить фазовый сдвиг и дифракцию, что приводит к сокращению размера гало вокруг образца. Наиболее простым способом избавления от гало или уменьшения интенсивности свечения является замещение среды наблюдения на среду с более высоким показателем преломления, такую как глицерин, маннит, декстран или сывороточный альбумин. В некоторых случаях изменение показателя преломления среды может даже привести к обращению контраста, при котором темные детали образца станут светлыми без существенного влияния на интенсивность фона.

Эффект гало может быть также существенно уменьшен применением фазово-контрастных объективов специальной конструкции, в которых рядом с задней апертурой объектива помещается небольшое кольцо нейтральной плотности, окружающее центральное фазовое кольцо. Такие объективы, называемые аподизированными фазово-контрастными объективами, позволяют наблюдать и фотографировать структуры фазовых объектов, порождающих большие фазовые сдвиги, с необычайной резкостью и различением деталей. В большинстве случаев, внутриклеточные структуры (такие как ядрышки), отчётливо контрастирующие на светлом фоне при наблюдении их в аподизированные объективы, оказываются либо имеющими светлые гало, либо просто изображаются яркими пятнышками при использовании обычной фазово-контрастной оптики. Благодаря большой амплитуде дифрагированного света по отношению к свету, не отклоняемому при прохождении образца, аподизированной оптикой можно добиться обращения контраста.

На практике, уменьшение гало и увеличение контраста образца аподизированными оптическими системами может быть достигнуто применением селективных амплитудных светофильтров, непосредственно прилегающих к фазосдвигающим плёнкам фазовых пластинок, встроенных в объектив в его задней фокальной плоскости. Эти амплитудные фильтры представляют собой тонкие плёнки нейтральной плотности, нанесённые на фазовые пластины вокруг фазосдвигающих плёнок. Коэффициент пропускания фазосдвигающего кольца обычной фазовой пластины приблизительно равен 25 процентам, тогда как пара колец, прилегающих снаружи к фазосдвигающему кольцу на аподизированной пластине, имеет нейтральную плотность с коэффициентом пропускания около 50 процентов. Ширина фазосдвигающей плёнки на обеих пластинах одинакова. Эти значения согласуются с коэффициентами пропускания фазосдвигающих плёнок, нанесённых на стандартные пластины в фазово-контрастном микроскопе.

Рис. 8. Переход контраста в позитивном и негативном контрасте

Переход контраста является другим распространённым артефактом в фазово-контрастной микроскопии и легче всего наблюдается в больших по размеру, протяжённых фазовых образцах. Было бы естественным ожидать, что изображение большого фазового образца с постоянной оптической длиной пути по своему диаметру окажется в микроскопе однородно тёмным или светлым. К сожалению, зависимость между интенсивностью изображений, формируемых фазово-контрастными микроскопами, и оптической разностью хода, создаваемой образцом, не всегда носит линейных характер. Другие факторы, такие, как поглощение фазовой пластины и величина задержки или опережения фазы, а также относительное перекрывание фазовой пластины и конденсорного кольца, тоже играют немаловажную роль. Часто, профиль интенсивности большого по размеру однородного толстого позитивного фазово-контрастного образца постепенно растёт от краёв к центру таким образом, что яркость света в центральном участке может приближаться к яркости окружающей среды (обратное верно для негативных фазовых образцов). Этот эффект, называемый переходом контраста, часто проявляется при наблюдении протяжённых плоских образцов, таких, как стеклянные или слюдяные пластины, отпечатки, уплощённые тканевые культуры клеток и большие органеллы.

Эти артефакты гало и перехода контраста как в позитивном, так и в негативном фазовом контрасте представлены на рисунке 8 для гипотетического протяжённого фазового образца прямоугольной формы с показателем преломления, более высоким по сравнению с окружающей средой (рисунок 8(a)). " Диаграмма распределения интенсивности вдоль центрального участка образца, представлена на рисунке 8(b). В изображении образца в позитивном фазовом контрасте (рисунок 8©) наблюдается отчетливое яркое гало и существенный переход контраста, который выражается в нарастающей по ходу от краёв образца к его центру интенсивности (см. диаграммы интенсивности на рисунке 8(d)). В негативном фазовом контрасте (рисунки 8(e) и 8(f)) эффекты гало и перехода контраста имеют обратные интенсивности. Тёмное гало окружает изображение образца при наблюдении его в негативную фазово-контрастную оптику (рисунок 8(e)), а переход контраста при этом проявляется в смене тона от яркого серого у краёв до тёмных уровней серого в центре. К тому же диаграмма интенсивности оказывается обратна (рисунок 8(f)) к наблюдаемой в позитивном фазовом контрасте.

Явление перехода контраста часто называется эффектом зоны действия, поскольку в центральных участках, где образец имеет однородную толщину, свет дифрагирует не так, как на краях и границах — высоко отражающих зонах. В центральных участках образца и относительные углы, и доля дифрагированного света значительно меньше по сравнению с краями. Поскольку дифрагированные волновые фронты, исходящие из центральной зоны образца, имеют минимальное пространственное отклонение от неотклонённых прямых волновых фронтов нулевого порядка (но, тем не менее, отстают от них по фазе на четверть длины волны), они, вместе с прямым светом, захватываются фазовой пластинкой в задней фокальной плоскости объектива. В результате, интенсивность центральной зоны образца почти совпадает с интенсивностью фона. Явление перехода контраста в относительно плоских участках образца, наряду с ярко выраженным контрастом на его краях и границах, служит веским доказательством того, что фазовый контраст управляется комбинированным действием дифракции и рассеяния.

Артефакты гало и перехода контраста зависят от геометрических и оптических свойств, как фазовой пластины, так и исследуемого образца. Особенно важную роль в этом играет ширина и коэффициент пропускания фазовой пластины (ширина фазовой пластины обычно составляет около одной десятой от общей апертурной области объектива). Фазовые пластины с большей шириной имеют меньший коэффициент пропускания и дают более интенсивные гало и переходы контраста, тогда как диаметр кольца имеет меньшее влияние на эти эффекты. Отчётливость эффектов гало и перехода контраста зависит от оптической разности хода и размера образца, его формы, структуры, которые могут быть различными в различных наблюдениях, осуществляемых различными фазовыми объективами (позитивными или негативными). К тому же, существенно влияние на эти эффекты оказывает и увеличение объектива (чем оно меньше, тем лучше изображения).

Выводы

Фазовый контраст является превосходным методом усиления контраста тонких прозрачных образцов без ущерба для разрешающей способности и оказался, к тому же, весьма ценным инструментом изучения динамических процессов внутри живых клеток. До появления фазово-контрастных оптических систем клетки и другие полупрозрачные образцы наблюдались в светлопольном освещении методом искусственного окрашивания. Хотя такие образцы можно наблюдать и визуализировать в темнопольном и косом освещении, или расфокусированным светлопольным микроскопом, такая методика оказалась ненадёжной с точки зрения предоставления наиболее важной информации о структурах клеток и их функционировании.

Метод фазового контраста широко применяется в биологических и медицинских исследованиях, особенно в цитологии и гистологии. Этот метод, по существу, применяется для изучения живых клеток, тканей и микроорганизмов, прозрачных в светлопольном освещении. Фазовый контраст позволяет легко визуализировать внутренние клеточные компоненты, такие как мембраны, ядра, митохондрии, веретёна, митотический аппарат, хромосомы, аппарат Гольджи, а также цитоплазматические гранулы как растительных, так и животных клеток и тканей. К тому же, фазово-контрастная микроскопия широко применяется для диагностики опухолевых клеток и изучения роста, динамики и свойств различных живых клеток в культурах. Специальные фазово-контрастные оптические системы с большим рабочим расстоянием были разработаны для инвертированных микроскопов, применяемых для изучения тканевых культур. Другими областями биологии, где преимущества фазового контраста оказались весьма полезны, являются гематология, вирусология, бактериология, паразитология, палеонтология и морская биология.

Промышленное и химическое приложение фазового контраста охватывает исследования в минералогии, кристаллографии и морфологии полимеров. Бесцветные микрокристаллы, порошки, измельчённые твёрдые частицы и кристаллические полимеры с показателем преломления, несколько отличающимся от окружающей иммерсионной жидкости, часто хорошо видны в фазово-контрастной микроскопии. На самом деле, количественная рефрактометрия часто применяется для определения значений показателей преломления и для подобных целей. Другими коммерческими продуктами, исследуемыми методом фазового контраста, являются клеи, жиры, масла, мыла, красители, краски, пищевые продукты, лекарства, ткани и другие волокна.

Фазово-контрастная микроскопия падающего света, хотя в значительной степени и потеснённая методом дифференциального интерференционного контраста, является эффективной в исследовании поверхностей, включая интегральные микросхемы, дислокации и другие дефекты кристаллов и литографию. Показательным примером является контроль дефектов укладки в кремниевых пластинах с эпитаксиальным слоем, имеющий огромное значение в полупроводниковой промышленности. В фазово-контрастных системах отражённого света изображение освещающего кольца проецируется в заднюю фокальную плоскость объектива, где обычно помещается фазовая пластина. К тому же, сама фазовая пластина располагается вне объектива, а изображение задней фокальной плоскости формируется вспомогательной системой линз, которая устраняет все отражения и рассеяния, производимые фазовой пластинкой. Необходимо заметить, что в фазово-контрастной микроскопии отражённого света разность фаз генерируется при отрыве от поверхности образца, а не на фазовых градиентах внутри него.

Уменьшение эффектов гало и перехода контраста остаётся главной проблемой фазово-контрастной микроскопии. Этого удаётся достичь аподизированными фазовыми пластинами и специальными настраиваемыми фазово-контрастными системами, позволяющими контролировать эти эффекты и оптимизировать качество изображения и точность получаемой этим методом информации. Существует, также, значительный интерес к развитию передовых фазово-контрастных систем, обеспечивающих точные измерения фазовых образцов с большой оптической разностью хода, равно как и к наблюдениям в сочетании с другими методами усиления контраста. В частности, фазовый контраст часто применяется вместе с флуоресцентными методами визуализации для определения положения флуорофоров и имеет хорошие перспективы для усиления контраста в сканирующей оптической микроскопии.