Принципы фазово-контрастной микроскопии (II)

Уменьшение гало в аподизированном фазовом контрасте

Разница в поглощении света между различными внутриклеточными компонентами и плазматической мембраной живых клеток часто пренебрежимо мала, что делает их едва заметными при наблюдении в микроскоп, по методу традиционного светлопольного освещения. Фазово-контрастная микроскопия позволяет использовать эти мельчайшие различия в показателях преломления между компонентами клеток, и между неокрашенными клетками и окружающей водной средой для формирования контрастного изображения этих и подобных им образцов.

Рис. 1. Ход лучей в фазовом контрасте

В фазово-контрастной микроскопии для освещения образца применяется свет, проходящий через кольцевую апертуру или кольцо, помещённое в передней фокальной плоскости конденсора (рисунок 1). При падении полого конуса света, исходящего из фазового кольца, на прозрачный образец, свет либо преломляется (дифрагирует) на внутриклеточных компонентах и мембране, либо проходит сквозь них не отклоняясь. Свет, прошедший через образец без отклонений, образует на задней фокальной плоскости объектива кольцо, тогда как более слабый свет, дифрагированный в образце, распределяется по всей фокальной плоскости. Дифрагированный свет оказывается несколько смещённым по фазе (примерно на одну четверть волны) относительно прямого света.

Фазовый сдвиг между прямым (фоновым) и дифрагированным в образце светом служит причиной интерференции этих пучков друг с другом в плоскости промежуточного изображения. Это достигается путём добавления или вычитания четвертьволнового сдвига из фазы прямого света с помощью полупрозрачной фазовой пластины, специально помещённой в плоскость (заднюю фокальную плоскость объектива), сопряжённую с кольцом конденсора (передней фокальной плоскостью конденсора). Прямой фоновый свет ослабляется тонкой плёнкой нейтральной плотности, нанесённой на фазовое кольцо объектива. В результате, в плоскости промежуточного изображения возникает интерференционная картина, в которой интенсивности пропорциональны фазовому сдвигу, создаваемому образцом.

К сожалению, в фазово-контрастной микроскопии имеет место такой артефакт, как гало эффект, который проявляется в возникновении ложных светлых областей вокруг фазовых объектов и обратного контраста в изображениях. Он особенно заметен в образцах, порождающих большой фазовый сдвиг. Уменьшение эффекта гало считалось когда-то трудной теоретической проблемой, но недавние достижения в проектировании фазовых колец объективов привели к появлению нового метода, называемого аподизированный фазовый контраст (рисунок 2), который позволяет наблюдать и фотографировать структуры фазовых объектов с большой оптической разностью хода с исключительной резкостью и разрешением деталей.

Рис. 2. Конфигурация аподизированных фазовых пластин

На рисунке 2 обычная (или традиционная) и аподизированная фазовые пластины для удобства сравнения представлены в разрезе, проходящем через центр, и расположены под углом к читателю. На поверхность обычной фазовой пластины слева, которая помещается в заднюю фокальную плоскость объектива, нанесено покрытие нейтральной оптической плотности (называемое фазосдвигающей плёнкой) в виде кольца. Назначение плёнки состоит в задержке фазы проходящего через образец прямого света на четверть длины волны, что обеспечивает усиливающую или ослабляющую интерференцию с дифрагированным светом в плоскости промежуточного изображения. Справа на рисунке 2 представлена аподизированная фазовая пластина. По обе стороны от фазосдвигающей плёнки нанесены два полупрозрачных покрытия нейтральной плотности, снижающие интенсивность света, дифрагированного в образце под малыми углами.

Эффект, оказываемый аподизированными фазовыми пластинами на видимое в микроскоп изображение, проиллюстрирован на рисунке 3 для двух образцов. Рисунок 3(a) является микрофотографией эмбриона морской звезды, снятой микроскопом Nikon Eclipse E600 в режиме обычного фазового контраста. Применяемым объективом был объектив с большим рабочим расстоянием (LWD) Ph1 DL (тёмный), дающий тёмные изображения на светло-сером фоне. Объективы этого типа наиболее часто применяются в стандартных фазово-контрастных исследованиях клеток и другого живого материала, поскольку они дают наибольший контраст в объектах со значительной разницей в показателях преломления. Обратите внимание на гало по периферии эмбриона и отсутствие контраста и деталей изображения в центре клеточной массы. Значительное усиление контраста наблюдается, когда такой объектив используется с аподизированными фазовыми пластинами, как показано на рисунке 3(b). На этом рисунке очевидно существенное уменьшение гало по периферии эмбриона морской звезды, более резкие края с отчётливыми внутренними деталями образца и явно увеличенная глубина поля.

Рис. 3. Сокращение эффекта гало в аподизированном фазовом контрасте

Пара подобных микрофотографий представлена на рисунках 3(с) и 3(d), на которых изображена живая эвглена. Эвглена является представителем отдела эвгленовых водорослей, замечательных простейших одноклеточных организмов, многие из которых одновременно демонстрируют свойства растений и животных. На рисунке 3(с) представлено обычное фазово-контрастное изображение эвглены, полученное DL фазовым объективом. Внешняя мембрана клетки на этом изображении окружена заметным гало, а внутренние детали образца довольно расплывчаты. При наблюдении этого же образца аподизированной фазовой оптикой (рисунок 3(d)), размер гало уменьшается, и повышается разрешение внутренних деталей образца.

Теория аподизированного фазового контраста

Показатель преломления (n) большинства фазовых объектов, особенно живых клеток, лежит между 1.36 и 1.37 при средней длине волны освещения, приходящейся на середину видимого спектра (550 нанометров). Для образцов сферической формы разность фаз между образцом и окружающей средой растёт с ростом их размеров, приводя к меньшим углам дифракции отклонённого образцом света. Для сферического образца максимальная разность фаз
(δ) и диаметр (d) связаны следующим уравнением:

δ = (2π/λ)(n' — n)d (1)

где λ — длина волны света в вакууме (или воздухе), n' — показатель преломления образца, а n — показатель преломления окружающей среды (обычно буферный водный раствор). Из уравнения видно, что увеличение диаметра образца (d) приводит к соответствующему росту разности фаз (δ) в освещающем волновом фронте при постоянных показателях преломления образца и окружающей среды.

Теперь предположим, что дифракционная картина формируется круговой апертурой диаметра d. В идеальном случае, когда объектив свободен от аберраций и имеет правильную круговую апертуру, две соседние точки разрешимы, если центры их дисков Эри разделены расстоянием r -радиусом диска Эри. Значение r определяется уравнением:

r = 0.61λ/n(sin(θ)) (2)

где λ — длина волны света в воздухе в качестве окружающей среды, а θ угол дифракции (апертурный угол). Если предположить, что диаметр апертуры d равен разрешающей способности r, тогда:

r = d = 0.61λ/n(sin(θ)) (3)

что преобразуется к:

sin(θ) = 0.61λ/nd (4)

Подстановка уравнения (1) в уравнение (4) даёт:

sin(θ) = (2π/λ)(n' — n)0.61λ/nδ (5)

sin(θ) = 2π(n' — n)0.61/nδ (6)

При малом угле дифракции (θ) член уравнения sin(θ) и разность фаз (δ) обратно пропорциональны друг другу:
sin(θ)≈ 1/δ (7)

Чтобы понять соотношение интенсивностей дифрагированного и прямого света в плоскости промежуточного изображения, необходимо сначала рассмотреть физические аспекты освещающих волновых фронтов. Если освещающий волновой фронт является однородной плоской волной, то падающий волновой фронт (φ(0)) и волновой фронт после прохождения фазового объекта (образца) (φ(1)) описываются следующими уравнениями:

φ(0) = sin(ωt) (8)

φ(1) = sin(ωt + δ) (9)

где ω — угловая частота освещающего волнового фронта, t — время, а δ — относительная разность фаз между волновыми фронтами, прошедшими через образец и окружающую среду. В большинстве случаев δ мала, поэтому уравнение (9) сводится к:

φ(1) = sin(ωt) + δcos(ωt) (10)

Первый член уравнения (10) описывает падающую световую волну (уравнение (8)) и представляет недифрагированный или прямой свет, прошедший через и вокруг образца, тогда как второй член обозначает количество света, рассеянного в образце. В большинстве случаев, разность фаз между дифрагированным и прямым светом составляет четверть длины волны, а амплитуда дифрагированного света пропорциональна разности фаз, создаваемой образцом. Принимая во внимание прибавление (или вычитание) четверти длины волны к прямому свету с помощью соответствующей фазосдвигающей пластины в задней фокальной плоскости объектива, уравнение (10) сводится к:

φ(1) = (1 + δ) cos(ωt) (11)

Чтобы получить интенсивность (I) волны в плоскости промежуточного изображения, можно взять уравнение (11) в квадрат и проинтегрировать его, избавившись, таким образом, от временной зависимости:
I = (1 + δ)² (12)

Яркость изображения получается пропорциональной (1 + δ)², поскольку интеграл от косинуса является константой. Таким образом, нам удалось установить связь между углом дифракции, амплитудой дифрагированного в образце света и разностью фаз. Из уравнения (12) видно, что интенсивность света в плоскости промежуточного изображения пропорциональна сумме амплитуд прямого и дифрагированного света. Необходимо заметить, что интенсивность дифрагированного света зависит от координаты в поле, тогда как прямой свет равномерно распределён в плоскости изображения.

Аподизированные фазовые пластины

На практике, уменьшение гало и увеличение контраста образца может быть достигнуто применением селективных амплитудных светофильтров, непосредственно прилегающих к фазовым пластинам, встроенным в объектив в его задней фокальной плоскости. Эти амплитудные фильтры представляют собой тонкие плёнки нейтральной плотности, нанесённые на фазовые пластины вокруг фазосдвигающих плёнок, как показано на рисунке 2. Коэффициент пропускания фазосдвигающего кольца обычной фазовой пластины приблизительно равен 25 процентам, тогда как пара колец, прилегающих снаружи к фазосдвигающему кольцу на аподизированной пластине, имеет нейтральную плотность с коэффициентом пропускания около 50 процентов. Ширина фазосдвигающей плёнки на обеих пластинах одинакова. Эти значения согласуются с коэффициентами пропускания фазосдвигающих плёнок, нанесённых на стандартные пластины в фазово-контрастном микроскопе.

Рис. 4. Углы дифракции в аподизированном фазовом контрасте

Необходимая ширина окружающих плёнок нейтральной плотности может быть определена по величине угла дифракции (θ), фигурирующего в уравнениях (2) — (7). Это значение в некоторой степени зависит от образца, но серийно выпускаемые компанией Nikon рассчитаны на объекты (образцы) диаметром приблизительно 10 микрон, что является типичным размером клеток, исследуемых в тканевой культуре.

Основные принципы метода аподизированного фазового контраста на примере большого и мелкого образца представлены на рисунке 4. Соотношение разности фаз для образцов различных размеров серьёзно влияет на ослабление света аподизированными фазовыми пластинами. Значительная часть света, дифрагированного образцом большого размера (больше или равного 10 микронам, рисунок 4 (а)), проходит через поглощающие кольца нейтральной плотности и значительно ослабляется, приводя к падению интенсивности. С другой стороны, от образцов меньше 10 микрон, таких, как ядра, плазматические мембраны и цитоплазматические гранулы, благодаря большому углу дифракции дифрагированный свет рассеивается в области, внешние по отношению к кольцам нейтральной плотности. В этом случае амплитуда дифрагированного света не ослабляется прозрачной частью фазовой пластины, и придает деталям образца высокий контраст (правда, не избавляя их от сопутствующего гало).

Метод аподизации был успешно применён и с другими оптическими конфигурациями для уменьшения интенсивности прямого света в апертуре. В любой дифракционно-ограниченной системе формирования изображения, функция рассеяния точки обычно имеет боковые лепестки или боковые кольца значительной интенсивности. Эти артефакты могут создавать серьёзные трудности в системах, предназначенных для различения слабого точечного источника света, расположенного рядом с сильным точечным источником. Термин аподизация происходит от греческого слова, означающего «убрать стопу». В оптических терминах «стопа» означает боковые лепестки или боковые кольца в дифракционно-ограниченных системах формирования изображения. Подобный метод, часто применяемый при формировании цифрового изображения, известен под термином отсечение (кадрирование)

Аподизированный фазовый контраст

Вообще говоря, аподизация в оптических системах требует ослабления (а в некоторых случаях и усиления) амплитуды света, проходящего через выходной зрачок. Степень ослабления обычно пренебрежимо мала в центре зрачка, но растёт с радиусом и становится наибольшей у краёв зрачка вблизи апертуры. Другими словами, края изображения в апертуре могут быть «смягчены» введением в систему ослабляющей свет маски. Поскольку дифракция в обрывистой апертуре приводит к возникновению на её границах краевых волн, смягчающий эффект позволяет распределить дифрагированные таким образом волны по большей площади. Это приводит к подавлению «звона», порождённого краевыми волнами.

Обычно, аподизация применялась для плавного изменения коэффициента пропускания на краях светового пучка, проходящего через выходной зрачок оптической системы, для подавления боковых лепестков вокруг функции рассеяния точки. Однако, в последние годы аподизация применяется и в других системах и используется для характеристики любого поглощения в выходном зрачке, независимо от того, подавляются или усиливаются боковые лепестки.

В заключение, применение оптики аподизированного фазового контраста приводит к существенному улучшению изображений за счёт уменьшения гало и усиления контраста мелких деталей образцов. В большинстве случаев, внутриклеточные структуры (такие как ядрышки), отчётливо контрастирующие на светлом фоне при наблюдении их в аподизированные объективы, оказываются либо имеющими светлые гало, либо просто изображаются яркими пятнышками при использовании обычной фазово-контрастной оптики. Благодаря большой амплитуде дифрагированного света по отношению к свету, не отклоняемому при прохождении образца, аподизированной оптикой можно добиться обращения контраста.

Контраст изображения фазового объекта можно менять модуляцией коэффициента пропускания и размера круговых зон нейтральной плотности вокруг центральной фазосдвигающей плёнки. Если, к тому же, коэффициент пропускания в таких зонах имеет градиент, тогда контраст объекта регулируется более точно для образцов различных размеров.

Конфигурация фазово-контрастного микроскопа

Фазово-контрастные оптические компоненты могут быть добавлены практически в любой светлопольный микроскоп, при условии, что специальные фазовые объективы соответствуют длине его тубуса, а в конденсор может быть установлено фазовое кольцо необходимого размера. Все основные производители поставляют вспомогательные фазово-контрастные устройства к своим исследовательским и обучающим микроскопам, как в прямой, так и в инвертированной (для тканевых культур) конфигурации.

Рис. 5. Фазово-контрастные оптические компоненты

Типичные фазово-контрастные компоненты, используемые с прямым исследовательским микроскопом Nikon серии Eclipse представлены на рисунке 5, хотя подобные вспомогательные устройства выпускаются и другими производителями. Конденсор, представленный на рисунке 5 является универсальной системой и предназначен для приложений с широким диапазоном увеличений (от 2х до 100х) с применением вспомогательных устройств, используемых в нескольких методах усиления контраста, включая дифференциальный интерференционный контраст (ДИК), режим тёмного поля и фазовый контраст. Объективы, содержащие внутренние фазовые пластины, предлагаются с различной степенью оптической коррекции — от простых ахроматов до планапохроматов. В дополнение, с целью достижения различных степеней контраста и интенсивности фона, предлагаемые фазовые пластины обладают несколькими уровнями ослабления прямого волнового фронта. Позитивные и негативные фазовые объективы также выпускаются многими производителями.

Для юстировки конденсорного кольца с фазовой пластиной в задней фокальной плоскости объектива может быть применён фазовый телескоп (как показано на рисунке 5), который помещается в окулярный тубус наблюдательной насадки микроскопа.

Стоимость полного вспомогательного комплекта для фазового контраста колеблется от нескольких сотен до нескольких тысяч долларов в зависимости от степени коррекции объектива, сложности и оптической коррекции конденсора и наличия или отсутствия в комплекте фазового телескопа. Нижеследующие разделы дают более подробное описание этих компонентов и представляют собой руководство по конфигурации и юстировке фазово-контрастных микроскопов.

Конструкция конденсорного кольца

Фазово-контрастное кольцо (annulus на латыни означает кольцо) помещается в конденсоре прямого микроскопа или, если микроскоп инвертированный, в турели конденсора, закреплённой на штативе осветителя, и должно быть специально подобрано к используемому объективу, оснащённому соответствующей фазовой пластиной. Например, объективам с увеличением 20х и 100х, содержащим фазовую пластину вблизи плоскости дифракции (задней фокальной плоскости), потребуются конденсорные кольца различного диаметра, соответствующие увеличению объектива и его числовой апертуре. Благодаряподбору конденсорного кольца, соответствующего фазовой пластине объектива, можно выполнить юстировку микроскопа так, чтобы световые лучи, проходящие через кольцо накладывались на фазовое кольцо объектива и добиться, таким образом, фазово-контрастного освещения.

Большинство распространённых универсальных конденсорных систем, предназначенных для фазово-контрастной микроскопии, оснащены тремя или более сменными кольцевыми диафрагмами, применяемыми с объективами увеличением 4x, 10x, 20x, 40x, 60x, и 100x, содержащими соответствующие фазовые пластины. Конденсорное кольцо Ph1 (или эквивалентное ему), имеющее наименьшую апертуру, предназначено для использования с объективами кратностью 10x и 20x. Объективы промежуточного увеличения (40x и 60x) применяются с кольцами Ph2, тогда как объективам с наибольшим увеличением (и числовой апертурой) 100x необходимо кольцо Ph3, имеющее максимальную апертуру. Специальное конденсорное кольцо (PhL) применяется с объективами низкого увеличения (4x и 5x), когда поворотная линза конденсора удалена с оптического пути, а также такое кольцо устанавливается в конденсорах с большим рабочим расстоянием, предназначенных для лабораторных инвертированных микроскопов.

Рис. 6. Конфигурация универсальной турели конденсора

Конденсорные вставки с кольцами представляют собой круглые алюминиевые пластины с выбитыми концентрическими кольцевыми отверстиями различного диаметра (как показано на рисунках 5 и 6). После штамповочной операции выбивания колец, алюминиевые диски анодируются и покрываются абсолютно чёрной краской с сажевым наполнителем для поглощения рассеянного света и обеспечения заданной траектории для прошедших через кольцо световых лучей. Центральная диафрагма, размер которой зависит от апертуры и увеличения объектива, удерживается в центре пластины тремя тонкими перемычками на расстоянии 120 градусов одна от другой. Круглая пластинка либо впрессована, либо вклеена в совпадающую с ней по форме рамку (тоже анодированную и выкрашенную чёрным), которая крепится в круговом отверстии турели конденсора.

Турели современных универсальных конденсоров (см. рисунок 6) обычно содержат от пяти до восьми круговых отверстий, в которые можно вставить пластины для фазового контраста, темнопольного освещения и пластины с призмами Номарского (Волластона) для ДИК. В своей основе, конструкция этих пластин одинакова. Диафрагмы для темнопольного освещения изготовлены аналогично фазово-контрастным диафрагмам, только с большим диаметром и шириной колец, чтобы пропускать возможно более косые волновые фронты. Напротив, призмы ДИК врезаны в круговые пластины, вклеенные в анодированную рамку и вставленные в турель.

Фазово-контрастные кольцевые диафрагмы конденсора вставляются в турель в определённом положении и закрепляются в ней пружинным держателем, скользящим по внутренней стороне отверстия турели. Пружинным держателем кольцевая пластинка поддавливается, упираясь в регулировочные винты (или резьбовые штырьки), используемые для юстировки кольца в оптическом пути (как показано на рисунке 7). Предлагаемые некоторыми производителями конденсорные системы, специально предназначенные для фазового контраста, имеют встроенную систему юстировки колец. У таких конденсоров обычно имеется набор юстировочных винтов, которые приводятся в действие при утапливании оси каждого винта до смыкания с регулировочным винтом кольца. После того, как винты вошли в зацепление, конденсорное кольцо может быть отъюстировано с фазовой пластиной объектива вращением юстировочных винтов.

Рис. 7. Юстировка пластины с конденсорным кольцом

В любом случае, при использовании универсального конденсора для фазово-контрастных наблюдений оператор должен обязательно проверить положение рукоятки апертурной диафрагмы, чтобы убедиться, что она открыта шире диаметра конденсорного кольца. На самом деле, при проведении фазово-контрастных наблюдений эту диафрагму лучше всегда держать максимально открытой. Некоторые производители выпускают специально предназначенные для фазового контраста конденсоры с подпружиненным механизмом, который автоматически открывает ирисовую апертурную диафрагму конденсора при помещении фазового кольца в оптическом пути, но блокирует эту функцию в режиме светлопольного наблюдения. После проведения фазово-контрастных экспериментов, микроскоп может быть переведён в светлопольный режим, в котором раскрытие ирисовой диафрагмы конденсора регулируется в соответствии с числовой апертурой объектива.

Фазово-контрастные конденсоры выпускаются с широким диапазоном оптической коррекции — от базовой конструкции Аббе (без исправлений хроматической и сферической аберрации) до высоко скорректированных апланатических-ахроматических систем с высочайшей производительностью. Можно добавить, что специальные фазово-контрастные конденсоры могут работать с оптикой с большим рабочим расстоянием (LWD) как в прямых, так и в инвертированных микроскопах, что позволяет наблюдать образцы, содержащиеся в толстостенных сосудах. Многие из исследовательских инвертированных микроскопов, предназначенных для наблюдения тканевых культур, оснащены конденсорами со сверхбольшим рабочим расстоянием (ELWD), фазовые кольца которых позволяют наблюдать живые клетки, находящиеся в очень больших контейнерах.

Юстировка фазово-контрастного микроскопа

Характеристики вспомогательных фазово-контрастных устройств разных производителей могут существенно отличаться друг от друга, к тому же не существует общепринятого стандарта на размеры диафрагм фазовых колец (и фазовых пластинок объектива) в отношении их числовой апертуры и кратности увеличения. Как следствие, фазово-контрастные объективы микроскопа одного производителя обычно не сочетаются с фазовыми конденсорами другого производителя (и наоборот).

Одно время были очень распространены фазовые конденсоры с одним кольцом, но потом они были вытеснены моделями для универсальных конденсоров. Старые конденсоры требовали извлечения и вставки различных фазовых колец каждый раз при смене объектива — трудоёмкой и отнимающей много времени операции, которую необходимо было часто повторять, исследуя мелкие детали образца при различных увеличениях. Юстировка кольцевой диафрагмы конденсоров с одним кольцом выполняется аналогично тому, как это делается в более новых, универсальных конденсоров. Кольцевая пластина прижимается к пластинчатой или цилиндрической (винтовой) пружине в корпусе конденсора с помощью винтов или резьбовых штырьков с прямым шлицем или с внутренним шестигранником.

Чтобы настроить стандартный конденсор Аббе, ахроматический или апланатический конденсор для фазово-контрастных наблюдений, кольцевую диафрагму необходимо поместить в переднюю фокальную (апертурную) плоскость конденсора или вблизи неё. Апертурная ирисовая диафрагма некоторых моделей конденсоров, всегда находящаяся в фокальной плоскости, располагается в основании конденсора и непосредственно прилегает к щелевым отверстиям, через которые вставляются фазовые пластины или диафрагмы для темнопольного освещения. Апертурная плоскость других конденсоров располагается в их центральной части, труднодоступной для вспомогательных компонентов, таких, как фазовые кольца.

Фазово-контрастные объективы

Наиболее важной частью объективов, предназначенных для фазово-контрастной микроскопии, является специальная фазовая пластина, расположенная в задней фокальной плоскости (плоскости дифракции) или вблизи неё. Фазовые пластины разных объективов не являются взаимозаменяемыми, а, часто бывает, и просто вытравлены на одной из внутренних линз. Вытравленное кольцо покрыто частично поглощающей металлической плёнкой, понижающей пропускание света, и обычно, изготовлено таким образом, что при прохождении через него света, его фаза набегает на четверть длины волны по отношению к свету, прошедшему через остальную часть стекла.

Рис. 8. Фазово-контрастный объектив

Диаграмма обычного фазово-контрастного объектива в разрезе представлена на рисунке 8. На вынесенном рисунке показана фазовая пластина, располагаемая в задней фокальной плоскости. В остальных частях, включая большинство внутренних линз, объектив совпадает со стандартными объективами светлопольных микроскопов. Разнообразие фазово-контрастных объективов, выпускаемых основными производителями, охватывает почти все виды оптической коррекции, включая ахроматическую, планахроматическую, флюоритовую и апохроматическую. Такие объективы выпускаются, также, с коррекционными кольцами, компенсирующими разброс толщины покровных стёкол (для сухих светосильных объективов), а могут быть использованы и в наблюдениях в воде, глицерине и масле в качестве иммерсионных жидкостей. В дополнение, фазово-контрастные объективы изготавливаются с фазовыми пластинами различной нейтральной плотности и фазового сдвига, что позволяет добиваться различной степени контраста как в позитивном, так и в негативном режимах.

Nikon и другие производители выпускают множество фазово-контрастных объективов (см. рисунок 9), различающихся по знаку (позитивный или негативный) и по уровню контраста, от относительно низкого до очень высокого. В позитивном фазовом контрасте — наиболее распространённом режиме — оптически плотные части тонких образцов оказываются тёмными на фоне более светлых градаций серого. В негативном фазовом контрасте образцы выглядят светлыми на тёмном фоне, подобно картинке при темнопольном освещении.

На рисунке 9 сравниваются цифровые снимки, полученные выпускаемыми сегодня компанией Nikon фазово-контрастными объективами, и демонстрируется зависимость уровня контраста от нейтральной плотности фазовой пластины и величины отставания (или опережения) фазы прямого волнового фронта. Изображения являются снимками связанных и заключённых в среду нитчатых водорослей Zygnema в одном и том же поле зрения. На рисунках 9(a), 9(b) и 9(с) сравниваются тёмно-серый, тёмный и аподизированный фазово-контрастный объективы (DLL, DL и ADL, соответственно), формирующие изображения примерно одного контраста на относительно светлом сером фоне. Серый и светло-серыйфазово-контрастные объективы Nikon (рисунки 9(d) и 9(e)) демонстрируют позитивный и негативный фазовый контраст на средне-сером фоне. Свойства каждого из фазово-контрастных объективов Nikon обсуждаются ниже.

Рис. 9. Фазово-контрастные объективы Nikon

Достижение определённого уровня контраста фазово-контрастными объективами различного типа осложняется тем, что большие флуктуации показателя преломления и толщины образца могут привести к обращению контраста и рассеянию образцом значительной части лучей в области вне фокальной плоскости. Оптическая плотность поглощающего материала, нанесённого на фазовую пластину (для ослабления волнового фронта прямого света) и фазосдвигающие свойства фазовых пластинок (приводящие к отставанию или набеганию волнового фронта) оказывают существенное влияние на результаты наблюдений в фазово-контрастный микроскоп. Некоторые важные свойства различных фазово-контрастных объективов Nikon приведены ниже.

• DL (Тёмные(Тёмный Низкий) — Средний контраст) — Объективы DL дают темное изображение на светло-сером фоне, и являются стандартными объективами для многоцелевых фазово-контрастных наблюдений. Эти объективы формируют максимально контрастные изображения образцов, наиболее сильно отличающихся от окружающей среды по показателю преломления. Фазово-контрастные DL объективы чаще всего применяются для исследования клеток и других полупрозрачных живых тканей и особенно приспособлены для микрофотографирования и формирования цифрового изображения.
• DLL (Тёмно-серые(Тёмный Очень низкий) — Низкий контраст) — Подобные по своей конструкции DL объективам, объективы серии DLL, дают хорошие изображения в светлом поле и часто используются в качестве «универсальных» объективов в микроскопах, работающих в различных режимах освещения, таких как флуоресценция, ДИК, светлое поле и темное поле. Фазово-контрастные DLL объективы дают менее контрастные, по сравнению с DL объективами, изображения, но имеют более высокие коэффициенты пропускания, степени оптической коррекции и числовые апертуры по сравнению со стандартными аналогами DL. Большинство фазово-контрастных DLL объективов, предлагаемых производителями, обладают флюоритовой и апохроматической коррекцией.
• ADL (Аподизированные тёмные(Аподизированный Тёмный Низкий) — Средний контраст) — Недавно разработанные компанией Nikon аподизированные фазово-контрастные ADL объективы имеют вторичные кольца нейтральной плотности по обе стороны от центрального кольца фазовой пластины. Добавление вторичных колец помогает уменьшить нежелательные эффекты «гало» часто возникающие при наблюдении крупных по размеру частиц или деталей образцов (таких, как ядра, целые клетки и волокна) в фазово-контрастной микроскопии. Аподизированные объективы выпускаются с планахроматической оптической коррекцией и по уровню производимого ими контраста аналогичны объективам серии DL.
• DM (Серые(Тёмный Средний) — Высокий контраст) — Объективы DM дают темное изображение на средне-сером фоне. Эти объективы предназначены для формирования высококонтрастных изображений образцов, дающих малый фазовый сдвиг или имеющих небольшую разницу в показателе преломления, таких как тонкие волокна, жгутики, реснички, гранулы и частицы очень маленьких размеров. Ограниченные, как правило, более высоким увеличением и высокой числовой апертурой (флюориты и апохроматы), фазово-контрастные DM объективы весьма производительны при наблюдении очень тонких образцов, но при работе с толстыми образцами часто приводят к обращению контраста.
• BM (Светло-серые (Яркий Средний) — Высокий негативный контраст) — BM объективы, часто называемые негативными фазово-контрастными объективами, производят светлое изображение на средне-сером фоне. Объективы BM идеальны для визуального исследования бактериальных жгутиков, сгустков фибрина, мельчайших шариков и подсчёта кровяных телец.

Для удобства и быстрой идентификации фазово-контрастных объективов их важные характеристики, такие как увеличение, числовая апертура, длина тубуса, коррекция и т. д., часто выделяются зелёным цветом на корпусе объектива. По этому зелёному буквенно-цифровому коду их можно отличить от обычных светлопольных, поляризационных, флуоресцентных и ДИК объективов, на которых маркировка нанесена каким-нибудь другим или просто чёрным цветом. В дополнение, на корпусе фазово-контрастных объективов имеются надписи, говорящие о том, что объектив предназначен для фазового контраста, и соответствующие обозначения колец. Некоторые из наиболее часто встречающихся надписей, выгравированных на корпусах объективов, приведены в таблице 1.

Определить, является ли объектив фазово-контрастным, можно просто взглянув через его стекло на яркий свет: в фазово-контрастном объективе будет видно тёмное фазовое кольцо вокруг его центра.

Табл. 1. Маркировка фазово-контрастных объективов

Серия стандартных фазово-контрастных объективов с возрастающими числовой апертурой и увеличением представлена на рисунке 6. Как правило, с ростом числовой апертуры и кратности увеличения объектива ширина и диаметр фазовой пластины падают (при этом увеличивается размер конденсорного кольца). Изображения фазовых пластин в разрезе, также представленные на рисунке 10, помогают понять основные различия между позитивными и негативными фазовыми пластинами. Позитивная фазовая пластина создаёт тёмный контраст, а частично поглощающая плёнка, нанесённая на неё, предназначена для уменьшения амплитуды прямой волны. Помимо этого, в состав такой пластины входит задерживающий фазу материал, предназначенный для смещения фазы дифрагированного света на 90 градусов назад. В состав негативной фазовой пластины также входит и задерживающий фазу, и частично поглощающий материалы. Тем не менее, оба эти материала размещены в фазовом кольце таким образом, что воздействию (ослаблению и задержке фазы на 90 градусов) подвержена лишь недифрагированная прямая волна.

Рис.10. Апертуры объектива и фазово-контрастная оптика

Контраст в фазово-контрастных объективах модулируется изменением свойств фазовой пластины, включая степень поглощения металлической плёнки (или просветляющих покрытий), показатель преломления смещающего фазу материала и толщину фазовой пластины. Большинство доступных сегодня фазовых пластин производятся методом вакуумного напыления тонких диэлектрических и металлических покрытий на стеклянные подложки или непосредственно на поверхность одной из линз объектива микроскопа. Назначение тонкой диэлектрической плёнки состоит в сдвиге фазы, тогда как металлическая плёнка ослабляет интенсивность недифрагированного света. Некоторые производители дополнительно к этим тонким плёнкам применяют различные просветляющие покрытия для сокращения бликов и постороннего рассеянного света, отражающихся обратно в оптическую систему.

Если фазовая пластина не нанесена на поверхность линзы, она обычно вклеивается между двумя линзами, расположенными вблизи с плоскостью дифракции объектива. Толщина и показатели преломления диэлектрического, металлического и просветляющего покрытий, а также прозрачного клея тщательно подбираются для обеспечения необходимого фазового сдвига между дополнительной (дифракционной) и сопряжённой (окружающей) областью фазовой пластины. В оптической терминологии фазовые пластины, меняющие фазу прямого света по отношению к дифрагированному на 90 градусов (либо вперёд, либо назад), называются четвертьволновыми пластинами из-за их влияния на оптическую разность хода.

Фазовый телескоп

Если конденсорное кольцо, расположенное в передней фокальной плоскости конденсора, не отъюстировано, т. е. не соосно с фиксированной фазовой пластиной объектива (центр которой лежит на оптической оси), контраст, создаваемый фазово-контрастной оптической системой будет существенно хуже. Чтобы обеспечить правильную работу микроскопа и максимально повысить контраст, необходимо проводить юстировку задней фокальной плоскости объектива с конденсорным кольцом, когда оно находится в рабочем положении. Эта операция выполняется либо с помощью фазового телескопа, который может быть установлен в один из наблюдательных тубусов окуляра (вместо обычной окулярной линзы), либо линзой Бертрана встроенной в бинокулярный (или тринокулярный) тубус микроскопа.

Рис. 11. Фазовый телескоп

Фазовый телескоп, также часто называемый вспомогательным телескопом или вспомогательным микроскопом, состоит из простого двух- или трёхлинзового телескопа (представленного на рисунке 11), настроенного на работу в качестве объектива, и миниатюрной оптической системы окуляра, расположенной между телескопом и микроскопом. Фокусное расстояние фазового телескопа лежит в интервале между 150 и 200 миллиметрами, что позволяетфокусировать его на заднюю фокальную плоскость объектива, при установке в один из наблюдательных тубусов окуляров микроскопа. Если фазовый телескоп должным образом сфокусирован, в увеличенной задней фокальной плоскости объектива ясно видно пространственное расположение конденсорного кольца и фазового кольца объектива друг относительно друга. Имея перед глазами фиксированное фазовое кольцо объектива, оператор может настроить положение конденсорного кольца, добившись таким образом соосности двух элементов, необходимой для фазово-контрастных наблюдений (см. рисунок 12).

Микроскопы, первоначально предназначенные для поляризационных наблюдений или дифференциального интерференционного контраста, часто оснащаются линзой Бертрана, которая помещается в наблюдательный тубус окуляра или промежуточный тубус, расположенный между окулярной трубкой и собственно микроскопом. Линза Бертрана является несколько более сложной, чем простой фазовый телескоп, и действует как оборачивающая линза, проецирующая изображение фокальной плоскости объектива в плоскость промежуточного изображения микроскопа, расположенную в апертурной диафрагме окуляра. Таким образом, линза Бертрана, помещённая в оптическом пути микроскопа, позволяет наблюдать заднюю фокальную плоскость объектива (и соосность фазовой пластины/конденсорного кольца) через окуляр микроскопа. В большинстве микроскопов с линзой Бертрана, её можно помещать в оптический путь и удалять из оптического пути с помощью небольшого дискового переключателя, расположенного под окулярными тубусами. В более поздних моделях микроскопов линза Бертрана часто помещается на револьверную насадку вместе с линзами, меняющими кратность увеличения изображения. Юстировка производится небольшой кнопкой, с маркировкой положения линзы Бертрана буквой B или Ph. Обозначения 0 или другое число на кнопке относятся к линзе с определенной кратностью увеличения.

Как фазовый телескоп, так и линза Бертрана должны быть оснащены механизмом регулировки фокуса, поскольку положение задней фокальной плоскости объектива может меняться в зависимости от увеличения (и многих других факторов). Фокусировка стандартного фазового телескопа производится простым вращением окуляра (см. рисунок 7) до тех пор, пока задняя фокальная плоскость объектива не окажется в резком фокусе. Аналогичным образом, большинство линз Бертрана современных микроскопов оснащаются фокусировочным дисковым переключателем, позволяющим оператору фокусировать пару «линза Бертрана — окуляр» на фазовой пластине объектива. Применение специально подобранных объективов (парфокальных, имеющих одинаковую степень коррекции и длину тубуса) обеспечивает существенное постоянство положения задней фокальной плоскости при изменении увеличения, и избавляет, таким образом, от необходимости перефокусировать фазовый телескоп и линзу Бертрана.

Юстировка фазово-контрастного микроскопа

Перед юстировкой микроскопа для фазово-контрастных наблюдений, необходимо внимательно осмотреть прибор и убедиться, что все объективы содержат фазовые пластины и плотно посажены в револьверной головке. Объективы должны быть расположены в револьвере в порядке возрастания кратности увеличения, чтобы минимизировать частоту смены конденсорных колец. Объективы кратностью 10x и 20x обычно применяют с одним конденсорным кольцом, а 40x и 60x — с другим. Высоко скорректированные объективы, такие, как апохроматы, предназначенные для масляной иммерсии, обычно имеют близкую числовую апертуру и используются с одним и тем же конденсорным кольцом в широком диапазоне увеличения (от 40х до 100х). Для фазового контраста с низким увеличением (4х и 5х) обычно требуется конденсор с поворотно-откидной линзой и специальное конденсорное кольцо.

Рис. 12. Юстировка фазово-контрастной оптической системы

Пластины конденсорного кольца также должны быть расположены в последовательном порядке, начиная с кольца для объективов низкого увеличения и далее в сторону возрастания кратности увеличения. Вообще, весь диапазон увеличений может быть охвачен тремя или четырьмя отдельными кольцами. При использовании универсального конденсора, кольцо для самого низкого увеличения следует расположить справа от светлопольного отверстия, а остальные в соседних отверстиях в порядке возрастания. Часто, до или после фазово-контрастного наблюдения образец необходимо исследовать в светлом поле, поэтому такая конфигурация обеспечивает непрерывность эксперимента.

На рисунке 12 представлены изображения задней фокальной плоскости объектива в случае разъюстировки (рисунок 12(a) и 12(с)) и после юстировки (рисунок 12(e)) конденсорного и фазового кольца. Также, на этом рисунке представлены соответствующие изображения, наблюдаемые в окуляр (рисунок 12(b), 12(d) и 12(f)), которые демонстрируют, каким образец предстаёт в разъюстированном микроскопе (рисунок 12 (b) и 12(d)) и в микроскопе, юстировка которого проведена в соответствии с приведённой ниже процедурой (рисунок 12(f)).

Юстировку фазово-контрастного микроскопа рекомендуется проводить следующим образом:

• поместите ярко окрашенный образец на предметный столик и в режиме светлопольного освещения установите (вращением револьверной насадки) фазово-контрастный объектив 10х на оптическом пути. Приведите образец в фокус и закрывайте полевую диафрагму, пока она не попадёт в границы поля зрения. С помощью рукоятки регулировки высоты конденсора, расположите его таким образом, чтобы привести в фокус отдельные лепестки полевой диафрагмы, а с помощью основных юстировочныых винтов добейтесь того, чтобы полевая диафрагма располагалась в центре поля зрения. Внимательно проверьте конфигурацию микроскопа и убедитесь, что обеспечено освещение по Кёлеру, и образец приведён в резкий фокус.
• окрашенный образец, находящийся на предметном столике, замените на фазовый образец. В тех случаях, когда оптическая разность хода исследуемого образца минимальна (вследствие чего его визуализация может быть затруднена), юстировку микроскопа следует произвести по уже испытанному в фазово-контрастном режиме высококонтрастному образцу. Вращением турели конденсора поместите соответствующее кольцо (Ph1 или его аналог для объектива 10х) в оптический путь. Проверьте соответствие цветового кода или маркировки конденсорного кольца объективу. Проследите, чтобы положение рычажка апертурной диафрагмы конденсора соответствовало её наибольшему раскрытию (в конденсорах, специально предназначенных для фазового контраста это может обеспечиваться автоматически).
• если микроскоп оснащен линзой Бертрана, поверните её в нужное положение с помощью дискового переключателя. В противном случае, вместо одного из окуляров микроскопа вставьте фазовый телескоп в наблюдательный тубус.
• глядя в окуляр или фазовый телескоп, произведите фокусировку линзы Бертрана или телескопа до приведения фазовой пластины объектива в резкий фокус и до явного наложения яркого изображения конденсорного кольца на тёмное покрытие нейтральной оптической плотности, нанесённое на фазовую пластину. Во многих случаях, микроскоп первоначально может быть разъюстирован, в результате чего изображение кольца оказывается неточно совмещённым с покрытием нейтральной плотности на фазовой пластине (как показано на рисунке 12(а) и 12©).
• поворачивая с помощью пары отвёрток или соответствующих юстировочных винтов конденсорного кольца, добейтесь его совпадения с фазовой пластинкой объектива (рисунок 12 (е)). Примечание: не следует выставлять положение конденсорного кольца основными центрировочными рукоятками конденсора (обычно расположенными в установочной оправе конденсора, которым он крепится к микроскопу). Этим Вы можете и не добиться желаемой юстировки конденсорного кольца, но обязательно нарушите обеспеченные до этого условия освещения по Кёлеру.
• правильная центрировка конденсорного кольца гарантирует, что прошедшее через конденсор световое кольцо будет ослаблено покрытием нейтральной плотности, нанесённым на фазовую пластину объектива для понижения интенсивности изображения кольца. Свидетельством неправильной центрировки конденсорного кольца является появление яркого полумесяца на границе с покрытием нейтральной плотности на фазовой пластине объектива (рисунки 12(а) и 12©) Несовпадение изображения кольца с тёмным кругом фазовой пластины означает либо расфокусировку конденсора (и нарушение условий освещения по Кёлеру), либо то, что фазовый телескоп (или линза Бертрана) не сфокусированы на задней фокальной плоскости объектива. В некоторых случаях изображение конденсорного кольца оказывается размытым и вне фокуса даже при правильной фокусировке фазового телескопа (или линзы Бертрана) и конденсора. Это может быть вызвано низкочастотной дифракцией самого образца. В этом случае уберите образец с предметного столика и продолжите юстировку микроскопа.
• если изображение конденсорного кольца существенно отличается в размере от фазовой пластины объектива, возможно, в конденсоре установлено кольцо не того размера (что является наиболее вероятной причиной). Другой причиной, в случае применения иммерсионного масляного объектива высокой числовой апертуры, может быть то, что передняя линза используемого конденсора оассчитана на работу в иммерсионной жидкости. Тогда наложение изображения конденсорного кольца на фазовую пластину может быть затруднительным (или невозможным) без капли масла между конденсорной линзой и предметным стеклом (и/или между объективом и покровным стеклом).
• если конденсорное кольцо и фазовая пластина объектива отъюстированы между собой, в фазовом телескопе или окуляре, оснащённом линзой Бертрана, должно появиться изображение, представленное на рисунке 1(е). Это говорит о том, что микроскоп правильно настроен для наблюдения образца в фазово-контрастном освещении.
• замените фазовый телескоп окуляром или удалите линзу Бертрана из оптического пути и приступайте к наблюдению образца. На нейтрально- сером фоне (цвет которого зависит от нейтральной оптической плотности фазовой пластины объектива) должен быть виден образец высокого контраста.

Микроскоп, отъюстированный для фазового контраста, обычно сохраняет свою соосность при значительном числе смен объективов/колец, но при этом его юстировку необходимопериодически проверять. Разъюстировка микроскопа становится заметной по изображениям в окуляре (или на экране компьютера), которые начинают всё больше походить на изображения, наблюдаемые при светлопольном освещении.

Большинство производителей микроскопов вместе с набором вспомогательных фазово-контрастных устройств поставляют зелёный интерференционный или поглощающий фильтр, поскольку он даёт свет именно той длины волны, по которой производится первоначальная калибровка фазовых пластин объектива. В результате, установка такого фильтра в оптическом пути (обычно между освещающей линзой конденсора и полевой диафрагмой) приводит к усилению контраста. Основная часть серийно выпускаемых фазовых пластин создает четвертьволновой фазовый сдвиг в зелёном интервале видимой части спектра (т. е. на 550 нанометрах). Теоретически, при использовании белого света вместо монохроматического, интерференционное гашение будет происходить не для всех цветов, и контраст будет ослаблен. Такое ограничение должно особенно учитываться, когда для формирования фазово-контрастных изображений применяются ахроматические объективы, хроматическая аберрация которых исправлена только для зелёного участка спектра. Тем не менее, современные высоко скорректированные флюоритовые и апохроматические объективы часто дают пренебрежимо малую разницу в контрасте.

Залогом успешного формирования изображения при фазово-контрастном освещении является правильно проведённая юстировка микроскопа и равномерное распределение достаточно тонких образцов в среде для заливки на предметном стекле. Изображения образцов чрезмерной толщины часто страдают от внефокусной размывки и артефактов, вызванных обращением контраста, что затрудняет интерпретацию изображений. При использовании микроскопа в течение длительного времени необходимо периодическипроверять заднюю фокальную плоскость объектива, чтобы не допустить разъюстировки конденсорного кольца с фазовой пластинкой объектива.