Флуоресцентная микроскопия (Часть 3)

Параметры визуализации флуоресцентных белков

Флуоресцентные белки и их дериваты, далеко не полностью представленные в этом обзоре, имеют высокую степень универсальности и успешно применяются почти во всех биологических дисциплинах от микробиологии до системной физиологии. Эти уникальные зонды оказались чрезвычайно эффективными репортерами в изучении экспрессии генов, как в культивируемых клетках, так и в целых животных. В живых клетках флуоресцентные белки обычно используются для наблюдения местоположения и динамики белков, органелл и других клеточных компартментов, а также в качестве индикатора межклеточного белкового обмена. Количественный анализ при наблюдении флуоресцентных белков эффективно осуществляется различными способами, включая широкопольную, многофотонную и конфокальную микроскопию, которые, в сочетании, дают уникальную возможность заглянуть в запутанный мир клеточных структур и взаимодействий.

Рис. 1. Цифровое изображение локализованных химерных флуоресцентных белков

От сложных спектральных и физических свойств флуоресцентных белков зависит точность и эффективность любого количественного измерения. Многие из этих свойств, такие как коэффициент молярной экстинкции, квантовый выход, скорость фотообесцвечивания, зависимость спектральных профилей от pH, можно без труда измерить in vitro с помощью очищенных белков. Однако, другие важные и для некоторых экспериментов критические свойства, включая время формирования хромофора (созревание) и скорость разрушения белка in vivo, определить сложнее. В обычных экспериментах, лучше применять самые яркие и стабильные мономерные дериваты флуоресцентных белков, чтобы избавиться от необходимости сложных поправок на интенсивность фона и фотообесцвечивание, неизбежных в более тонких экспериментах.

При выборе векторов флуоресцентных белков для экспериментов по визуализации, в первую очередь необходимо иметь в виду серийно выпускаемые усиленные варианты, выделенные из медуз и кораллов, а также их дериваты. Их флуоресцентные профили охватывают голубой (ECFP), зелёный (EGFP) и жёлтый (EYFP) участки спектра, а сегодня уже появились мономерные флуоресцентные белки, испускающие в красном диапазоне. На рисунке 1 представлена подборка снимков, полученных с помощью серийно выпускаемых векторов со встроенными флуоресцентными белками, мишенями для которых явились несколько различных субклеточных структур. Флуоресцентные спектральные профили зондов, представленных на рисунке 1, охватывают полосу почти в 180 нанометров с максимумами в диапазоне от 440 до 618 нанометров. Эти красители являются наиболее яркими и стабильными вариантами флуоресцентных белков, которые позволяют регистрировать изображения в условиях низкой освещённости, что минимизирует фотообесцвечивание (обсуждается ниже) и фототоксичность. Многие варианты флуоресцентных белков (включая EGFP, ECFP и EYFP) при достаточно высоких концентрациях могут образовывать димеры, что приводит к возможному нарушению структуры мембраны и неверным допущениям при проведении количественного анализа передовыми флуоресцентными методами, как например резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET).

В дополнение к яркости, присущей генетически сконструированным флуоресцентным белкам, другим важным фактором обеспечения яркого внутриклеточного сигнала от гибридных конструкций является уровень экспрессии. Использование в векторах эффективных промоторов для усиления транскрипции и применение правильных кодонов для оптимизации трансляции существенны для повышения экспрессии гибридных белков, что в итоге приводит к усилению общего сигнала. Это особенно важно, когда автофлуоресценция клетки, создающая фоновую вуаль, затрудняет регистрацию свечения флуоресцентных гибридных белков.

Для усиления экспрессии гибридных флуоресцентных белков и яркости содержащих их клеток применяются различные способы. Например, улучшения общей экспрессии генов в стабильных клеточных линиях, экспрессирующих гибридный белок, можно добиться добавлением в культурную среду маслянокислого натрия (примерно от 1 до 5 микромолей). Использование временно трансфектированных клеток также является одним из способов, поскольку они часто демонстрируют гораздо более высокий уровень экспрессии по сравнению со стабильно трансфектированными клетками. Однако, применять врeменную трансфекцию следует с определённой степенью осторожности, поскольку этот метод не исключает артефактов, иногда возникающих при чрезмерной экспрессии, включая скопление белков и их переизбыток, что приводит к ошибкам в локализации. И наконец, увеличение числа тандемных последовательностей флуоресцентных белков (двойных или тройных) в клонирующем векторе является альтернативным способом повышения яркости гибридных белков.

Критические свойства флуоресцентных белков

Большинство серийно выпускаемых векторов флуоресцентных белков имеют улучшенные свойства благодаря оптимизации использования кодонов для трансляции в клетках млекопитающих и сайт-направленному мутагенезу, ускоряющему созревание хромофора при повышении температуры. В более сложных экспериментах, со слабой экспрессией и малым количеством мишеней для флуоресцентных белков, свойства, характерные для этих зондов, будут скорее иметь ограничивающее действие. Понимание этих особенностей, присущих флуоресцентным белкам, необходимо для минимизации артефактов, возникающих иногда при наблюдении этих красителей в экспериментах с живыми клетками.

Явление фоторазрушения хромофоров, известное как фотообесцвечивание, обычно (в одинаковых условиях) менее губительно для флуоресцентных белков, с точки зрения, как скорости, так и величины, чем для традиционных синтетических флуророфоров, таких как флюоресцеин и родамин. Эта устойчивость к фотообесцвечиванию, предположительно, возникает благодаря плотно упакованной белковой структуре, называемой beta-бочонком, которая защищает хромофор флуоресцентного белка. Но независимо от этого, в экспериментах, включающих количественный анализ, необходимо соблюдать строгие меры контроля обесцвечивания.

Рис. 2. Характеристики фотообесцвечивания флуоресцентных белков

Скорость фотообесцвечивания флуоресцентных белков можно определить по серии изображений окрашенных клеток, снятых через определённые временные интервалы, с последующей количественной оценкой падения интенсивности флуоресценции, которое обычно носит экспоненциальный характер. Кривая падения флуоресценции в результате фотообесцвечивания (рисунок 2) может быть использована для внесения поправок в эксперименты по визуализации. Фотообесцвечивание не всегда является существенной проблемой, но если при наблюдении живых клеток ограничения, накладываемые этим явлением, становятся значительными, добавление в культурную среду специальных реагентов, например аскорбиновой кислоты, тролокса (Trolox), оксиразы (Oxyrase: кислород и ловушка свободных радикалов) частично снимает проблему.

Острота этой проблемы во флуоресцентной микроскопии часто снижена благодаря тому, что скорость фотообесцвечивания многих дериватов флуоресцентных белков относительно низкая (см. рисунок 2). Другим ограничивающим фактором является насыщение флуророфоров, чего не возникает в широкопольной микроскопии, но что может стать серьёзной проблемой в лазерных сканирующих конфокальных измерительных приборах при достаточно высокой интенсивности возбуждения. Насыщение флуорофоров достигается, когда все доступные молекулы постоянно находятся в возбуждённом состоянии, поэтому рост интенсивности возбуждающего света не ведёт к росту флуоресцентного свечения. В этом случае, из-за нелинейности почти невозможно откалибровать флуоресцентный сигнал, поэтому единственным решением является снижение входной мощности лазера.

Внешние условия, в которых находится клетка, особенно кислотность и местные концентрации одновалентных и двухвалентных катионов, могут влиять на уровень яркости дериватов флуоресцентных белков. Например, яркость дикого зелёного флуоресцентного белка (wtGFP) почти не меняется при pH от 5 до 10, в то время как флуоресценция усиленных зелёного и жёлтого флуоресцентного белка тушится в кислой среде, что снижает эффективность окрашивания ими органелл (лизосом) или других субклеточных компартментов, имеющих низкий pH. Другие дериваты, такие как ECFP и DsRedFP, менее чувствительны к низкому pH. Но многие флуоресцентные белки локализованы в областях с pH, близким к физиологическому, поэтому интенсивность их флуоресценции не подвержена серьёзному влиянию среды.

Среди других характеристик, свойственных флуоресцентным белкам, которые могут существенно исказить результаты количественного анализа экспериментов (но которые нельзя точно измерить in vitro), наиболее важной является кинетика укладки, или время включения. Для формирования хромофора в дериватах медузы Aequorea victoria (и большинстве рифовых кораллов) необходимо окисление, но кислород не может сразу преодолеть плотную белковую структуру, окружающую трипептидный флуророфор. Поэтому задержка между экспрессией белка и возникновением флуоресценции может быть значительной (иногда больше нескольких часов). К сожалению, часто бывает невозможно определить, вызвана ли задержка экспрессией флуоресцентного белка (идеальное измерение), или медленным формированием хромофора (артефакт). Очень сложно проследить и обратный процесс — разрушение созревших флуоресцентных белков in vivo, — но подавляющее число экспериментов свидетельствует о высокой стабильности этих красителей.

Характеристики микроскопов

Широкопольные, конфокальные и многофотонные флуоресцентные микроскопы, в прямой или инвертированной конфигурации, являются идеальными инструментами для наблюдения флуоресцентных белков в живых клетках и тканях. Для этих целей применяются различные источники освещения: от ртутных и ксеноновых дуговых ламп в широкопольной микроскопии, до газовых и полупроводниковых лазеров непрерывного излучения в конфокальной микроскопии и импульсных лазеров с синхронизованными модами в многофотонной микроскопии (см. таблицу 1). Зелёные флуоресцентные белки и их варианты удобно наблюдать при ярком синем освещении ртутной лампы или при облучении аргоновым ионным или аргоново-криптоновым газовым лазером на длине волны 488 нанометров. К тому же, появляется множество новых твердотельных лазеров, излучающих в различных областях видимого спектра, включая фиолетовый и синий диапазоны. Варианты флуоресцентных белков со спектральными профилями, смещёнными в синий, красный и ближний инфракрасный диапазоны с большей эффективностью наблюдаются при облучении ксеноновыми или металлогалогенными лампами, а также лазерами, излучающими на длинах волн, близких к максимумам возбуждения. Но независимо от источника света, главным условием наблюдения флуоресцентных белков является достаточное возбуждение для достижения необходимого уровня сигнала.

Помимо объективов, обсуждаемых ниже, двумя наиболее важными компонентами для наблюдения флуоресцентных белков являются эмиссионный фильтр и фотоприёмник. В широкопольных микроскопах фильтр возбуждения, дихроичное зеркало и эмиссионный фильтр объединены в оптический блок с полосой пропускания фильтра возбуждения, определяемой облучающим источником света. Например, для ртутной лампы, применяемой для наблюдения зелёного флуоресцентного белка, требуется фильтр возбуждения с полосой пропускания между 450 и 490 нанометрами. Полосы пропускания волн с меньшими длинами необходимы для голубых и синих вариантов, а полосы больших длин волн применяются для жёлтых, оранжевых и красных дериватов. Лазеры имеют линии шириной не более нескольких нанометров, поэтому они обычно не требуют селекции интерференционными фильтрами. Спектральные профили возбуждения и испускания чётко делятся по длине волны отсечки дихроичного зеркала, которое эффективно отражает вожбуждающий свет и пропускает флуоресцентное свечение. Для выбора подходящего дихроичного зеркала существует лишь очень узкий диапазон. С другой стороны, эмиссионные фильтры могут быть настроены на пропускание волн в полосе шириной от 20 до нескольких сот нанометров, в зависимости от требований эксперимента. Эти фильтры являются наиболее гибкими в смысле определения интенсивности флуоресценции, попадающей на фотоприёмник. В таблице 1 приведён список предлагаемых комбинаций фильтров для визуализации и количественного анализа флуоресцентных белков. Эти рекомендации по выбору фильтров, включающие эмиссионные фильтры лишь с определённой полосой пропускания (и по сути, оставляющие без внимания широкополосные фильтры), следует рассматривать только как отправную точку при планировании экспериментов.

Рис. 3. Работа блока флуоресцентных фильтров при (синем) возбуждении GFP

Эффективность нескольких популярных фильтрационных наборов для наблюдения зелёных флуоресцентных белков можно оценить, сравнивая изображения, сформированные сигналами из одного и того же поля зрения, которые были пропущенны через отдельные комбинации фильтров, как показано на рисунке 3. Образцом в этом наблюдении является адгезивная культура миобластов грудной аорты эмбриона крысы, которые были трансфектированы вектором, несущим гибридный белок, слитый из гена цитоплазматического бета-актина человека и варианта (усиленного) зелёного флуоресцентного белка с красным смещением, EGFP. Экспрессия гибридного белка обнаруживается его внедрением в растущие филаменты актина, что позволяет визуализировать субклеточные структуры методами флуоресцентной микроскопии с помощью подходящей комбинации фильтров (см. рисунок 3). Миобласты грудной аорты были также окрашены митотрекером красным CMXRos (MitoTracker Red CMXRos; митохондрии: красная флуоресценция) и хёхстом 33258 (Hoechst 33258; ДНК в ядрах: синяя флуоресценция).

Примечательно, что при использовании фильтров Piston и Endow с определённой полосой пропускания на снимках отсутствуют сигналы от синего и красного флуророфоров (рисунок 3(a) и 3(b)), а на рисунке 3©, где применялся широкополосный фильтр Endow, очевидна интенсивная оранжево-красная флуоресценция митохондриального красителя. GFP комбинации фильтров как с определённой полосой пропускания (30 нанометров (Piston) и 50 нанометров (Endow BP), так и широкополосные (более100 нанометров (Endow LP)), являются эффективными и при наблюдении различных синтетических флуророфоров, возбуждаемых в синем диапазоне видимого спектра.

Хотя зелёные флуоресцентные белки при достаточно высокой интенсивности можно наблюдать и стандартной комбинацией флуоресцентных фильтров, применение специальных фильтров (см. рисунок 3) позволяет тонко настроить приём сигнала, добавляя или исключая различные его компоненты. В комбинациях фильтров, специально предназначенных для визуализации и количественного анализа GFP следует использовать узкополосные эмиссионные фильтры для увеличения сигнала от флуоресцентного белка по отношению к фону (обычно автофлуоресценции). При использовании узкополосного эмиссионного фильтра до фотоприёмника преимущественно доходит отчётливый зелёно-синий сигнал от флуоресцентного белка (рисунок 3(а)), при этом подавляется зелёно-жёлтый (рисунок 3(b)) и зелёно-оранжевый (рисунок 3(с)) фон от клеточной автофлуоресценции и других флуророфоров, испускающих волны большей длины. Для автофлуоресценции обычно характерен очень широкий спектр, в то время как зелёный флуоресцентный белок испускает в относительно узком диапазоне. В принципе, для подавления фоновых сигналов и выделения свечения флуоресцентного белка следует выбирать фильтры с как можно более узкой полосой пропускания. Тем не менее, выбор оптимальной полосы пропускания ограничен требуемым отношением сигнал-шум и характеристиками фотоприёмника, как обсуждается ниже. Оптимальную полосу пропускания необходимо определять для каждого отдельного наблюдения. В дополнение следует добавить, что хотя на рисунке 3 представлен усиленный зелёный флуоресцентный белок, выбор комбинации фильтров определяется не только интенсивностью сигнала, но и флуоресцентным спектральным профилем испускания визуализируемого варианта белка (см. таблицу 1).

Варианты синего флуоресцентного белка могут наблюдаться в широкопольной флуоресцентной микроскопии с использованием стандартных комбинаций фильтров DAPI с профилем фильтра возбуждения от 330 до 380 нанометров, длиной волны отсечки дихроичного зеркала от 385 до 400 нанометров и эмиссионным фильтром либо с определённой полосой пропускания, либо с широкой полосой (420 нанометров и выше). Эти комбинации фильтров, тем не менее, не очень эффективны для голубых флуоресцентных белков, оптимальные снимки которых получаются с применением фильтров, разработанных для визуализации флуророфоров, возбуждаемых сине-фиолетовым светом (400–440 нанометров). Длина волны отсечки дихроичных зеркал для голубых флуоресцентных белков должна лежать между 455 и 460 нанометрами, а полоса пропускания эмиссионных фильтров — охватывать диапазон от 460 до 500 нанометров. Многие из стандартных сине-фиолетовых комбинаций фильтров с ограниченной и широкой полосой пропускания могут с успехом применяться для визуализации дериватов голубого флуоресцентного белка (включая Лазурный (Cerulean) и AmГолубой1 (AmCyan1)), но производителями микроскопов и дополнительного оборудования выпускаются и специально разработанные для этих красителей фильтры.

При наблюдении дериватов жёлтого флуоресцентного белка (включая усиленные варианты, Венеру и Цитрин) с помощью комбинаций фильтров, разработанных для FITC и зелёных флуоресцентных белков, обычно получаются вполне приемлемые снимки, но всё же лучшие результаты достигаются при небольшом сдвиге профиля поглощения и испускания в сторону длинных волн, соответствующих этим красителям. Фильтры возбуждения с полосой пропускания от 490 до 510 нанометров, дихроичные зеркала с длиной волны отсечки 515 нанометров и эмиссионные фильтры, пропускающие в диапазоне от 520 до 550 нанометров, образуют идеальные комбинации для жёлтых флуоресцентных белков. Изображения жёлтых флуоресцентных белков хорошего качества получаются и при использовании широкополосных эмиссионных фильтров с длиной волны отсечки 515 нанометров или чуть больше.

Спектральные кривые оранжевых и красных флуоресцентных белков охватывают большой диапазон, поэтому, к сожалению, не существует одной комбинации фильтров, которая бы идеально подходила для наблюдения всех флуророфоров из этого набора. Варианты флуоресцентного белка DsКрасного (DsRed) часто наблюдаются с помощью стандартных комбинаций фильтров TRITC, а также многими широкополосными наборами и фильтрами с определённой полосой пропускания, предназначенными для красителей, поглощающих в зелёном участке видимого спектра. Для наблюдения оранжевых флуоресцентных белков (mOrange (mОранжевого) и CoralHue Orange (Оранжевого с коралловым оттенком)) следует применять фильтры возбуждения с полосой в интервале от 500 до 540 нанометров с сочетании с дихроичным зеркалом с длиной волны отсечки приблизительно 550 нанометров и эмиссионными фильтрами с полосами пропускания, ограниченными интервалом от 560 до 600 нанометров. Некоторые стандартные комбинации фильтров для зелёного возбуждения приблизительно отвечают этим требованиям, но для оптимальной визуализации специфичных флуророфоров этой категории лучше применять специально разработанные для них фильтры. Для красных флуоресцентных белков с большей длиной волны (mCherry (mВишня), HcRed1 (HcКрасный1), mRaspberry (mМалина) и mPlum (mСлива)) могут применяться комбинации фильтров для жёлтого возбуждения. Для многих из этих красных красителей, например, может быть использован наборY-2E/C компании Nikon с полосой пропускания фильтра возбуждения от 540 до 580 нанометров, с длиной волны отсечки дихроичного зеркала 595 нанометров и эмиссионным фильтром, пропускающим фотоны с длиной волны между 600 и 660 нанометрами. У производителей фильтров и микроскопов можно приобрести и заказные комбинации фильтров.

В лазерной сканирующей конфокальной микроскопии выбор длины волны возбуждения ограничен для каждого измерительного прибора набором доступных лазерных линий. Стандартные микроскопы оборудованы двумя или более лазерами, охватывающими фиолетовый (405 и 440 нанометров), синий (457, 477 и 488 нанометров), зелёный (514 и 543 нанометра), жёлто-оранжевый (568 и 594 нанометра) и красный (633 и 647 нанометров) участки спектра. На этих линиях можно эффективно возбуждать большинство флуоресцентных белков, представленных в таблице 1, при наличии соответствующих дихроичных зеркал и эмиссионных фильтров. Для визуализации большинства популярных дериватов флуоресцентных белков могут также применяться многофотонные микроскопы, но в ограниченных пространственных объёмах, что является характерной особенностью этих измерительных приборов.

Табл. 1. Характеристики фильтрационных блоков для флуоресцентных белков

В таблице 1 сведены свойства нескольких наиболее распространённых и потенциально эффективных вариантов флуоресцентных белков. Наряду с принятым названием и/или акронимом для каждого флуоресцентного белка в ней указаны оптимальные лазерные линии, а также, в качестве отправных точек, предложены полосы пропускания (и центральные длины волн) для фильтров возбуждения и эмиссионных фильтров. В таблицу также включены относительная яркость и характеристики рекомендуемых дихроичных зеркал. Относительная яркость высчитывалась делением произведения коэффициента молярной экстинкции и квантового выхода на яркость белка EGFP. Этот список был составлен на основе научных и технических работ и не претендует на полноту, но, напротив, представляет лишь те дериваты флуоресцентных белков, которые привлекли внимание исследователей и показали свою эффективность.

Обычно в количественной микроскопии, в качестве фотоприемников используются фотоэлектронные умножители и охлаждаемые камеры на приборах с зарядовой связью (ПЗС). Поскольку фотоумножители не являются формирователями изображения, для его поточечного построения необходима растровая развёртка образца (подобно той, которая выполняется при сканировании в лазерной конфокальной микроскопии). Светочувствительные элементы ПЗС, напротив, образуют линейки фотодиодов, формирующие двухмерные изображения, ограниченные в размере лишь числом диодных элементов. Помимо отношения сигнал-шум наиболее важными аспектами фотоприёмной системы является линейность и смещение. И фотоумножители, и ПЗС матрицы являются системами с высокой степенью линейности, а высокоэффективные ПЗС, как, собственно, и все фотоумножители, позволяют осуществлять корректировку смещения (часто называемого уровнем чёрного). На практике, смещение корректируется выставлением нуля при отсутствии флуоресценции от образца. Если этого не сделано, оценить количественную разницу между изображениями будет невозможно.

По сравнению с охлаждаемыми камерами на ПЗС, фотоумножители, применяемые в лазерных сканирующих конфокальных микроскопах, показывают невысокий динамический диапазон (8 бит или 256 уровней серого) и эффективность регистрации (от 15 до 30 процентов). Конечно, эффективность регистрации желательно иметь выше, но 8-битный динамический диапазон обычно не представляет проблемы, поскольку за один цикл сканирования (даже для сильно окрашенных образцов) обычно собирается не более 255 фотонов на пиксель. И всё же, высокая степень линейности отклика фотоумножителя наряду с возможностью корректировки фонового сигнала и наличием соответствующих лазеров делает конфокальный микроскоп превосходным инструментом для визуализации и количественного анализа флуоресцентных белков. Многофотонная микроскопия, исключающая фотоповреждение вне фокальной плоскости, свободная от хроматических аббераций и обладающая высокой разрешающей способностью в трёхмерных измерениях, также является эффективным инструментом визуализации флуоресцентных белков.

Наиболее важным параметром, определяющим применимость количественного анализа изображений, является отношение сигнал-шум (сокращённо С/Ш). В современных серийно выпускаемых флуоресцентных микроскопах это значение обычно выводится из дробового шума, определяемого как корень квадратный из числа собранных фотоприёмником фотонов. В фотоприемных устройствах могут возникать и другие системные ошибки, но они обычно малы в сравнении с дробовым шумом ПЗС и фотоумножителей. Например, если фотоприёмник собирает 100 фотоно на пиксель, шум ожидается равным 10 (квадратный корень из 100), или 10 процентов от уровня сигнала. Если же на один пиксель приходится 10?000 фотонов, шум (100) составляет всего 1 процент от сигнала. Уровни сигналов в этих примерах являются типичными для флуоресцентной микроскопии, а ошибки, возникающие в регистрирующей электронике, обычно не превышают 1-го процента. На первый взгляд, может показаться естественным, добиваться максимального отношения сигнал-шум, но в действительности такие факторы, как фотообесцвечивание, насыщение флуорофоров, количество флуророфоров в образце и пространственное разрешение накладывают на это отношение свои ограничения.

В большинстве случаев, флуоресцентные белки-метки и клеточные белки-мишени, с которыми они слиты, находятся в одинаковых пропорциях. Следовательно, концентрация флуоресцентных молекул в клетке может быть вычислена по полной клеточной флуоресценции и известным концентрациям рекомбинированных флуоресцентных белков в качетстве эталонной меры. Для этой цели обычно применяются усиленные зелёные флуоресцентные белки, поскольку они отличаются фотостабильностью и яркостью. Для подсчёта внутриклеточных концентраций EGFP известное количество маркера может быть введено в полиакриламидные пластинки, визуализируемые одновременно и рядом с клетками, экспрессирующими гибридные конструкции. Эталонные меры для подсчёта плотности мембраносвязанных белков могут быть выработаны путём присоединения точных количеств EGFP, связанного с гистидином, к окаймлённым гранулам. С последнее время спрос на методы количесвенного анализа экспрессии белков только увеличивается, поскольку благодаря новым методикам внедрения растёт применение флуоресцентных белков в качестве меток молекул целых организмов.

Выбор объективов для наблюдения флуоресцентных белков

Хотя выбор объектива, возможно, является самым важным моментом в планировании эксперимента, часто этому не уделяется должного внимания. Характеристики объектива являются первостепенными в определении пространственной разрешающей способности и количества света, достигающего светочувствительных элементов. В общем, объективы характеризуются тремя основными параметрами: числовой апертурой, увеличением и степенью оптической коррекции. Вопреки расхожему мнению, увеличение является наименее важным параметром. Увеличение определяет лишь, насколько большим покажется объект в окуляре или фотоприёмнике, но не влияет на разрешающую способность (размер наименьшей различимой детали) или яркость (количество собираемого флуоресцентного сигнала) изображения.

Рис. 4. Влияние числовой апертуры объектива на формирование флуоресцентных изображений

Разрешающая способность и яркость определяются числовой апертурой, которая является наиболее важным критерием при выборе объектива. Числовая апертура определяет количество света, проходящего через переднюю линзу, поэтому для количественного анализа изображений флуоресцентных белков следует выбирать максимально возможную числовую апертуру. Общий принцип формирования любого изображения прост: при возрастании отношения сигнал-шум, растёт и качество изображения. Этот принцип особенно критичен при формировании изображения в лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, где число собираемых фотонов весьма мало (обычно всего несколько фотонов на пиксель). Поэтому тщательный выбор объектива особенно необходим при оптимизации способа собирания фотонов. Заметим, что полная яркость изображения пропорциональна четвёртой степени числовой апертурой объектива, делённой на квадрат увеличения.

Важность числовой апертуры, как основного параметра, определяющего разрешающую способность и яркость изображения, показана на рисунке 4. В качестве образца взята культура адгезивных клеток остеосаркомы человека (U2OS линия), трансфектированных плазмидным вектором, кодирующим усиленный зелёный флуоресцентный белок, слитый с митохондриально направленной нуклеотидной последовательностью из субъединицы VIII цитохром-с-оксидазы человека. При транскрипции и трансляции в трансфектированных клетках-хозяинах млекопитающего, по сигналу, поступающему от митохондрий можно определить перенос и распределение химерных флуоресцентных белков по митохондриальной сети клетки. Впоследствии, методами флуоресцентной микроскопии можно визуализировать митохондриальные трубочки.

На рисунке 4 представлены результаты наблюдения одного и того же поля зрения объективами с одинаковой оптической коррекцией (plan fluorite) и числовой апертурой (1,3), но разным увеличением (от 40х до 100х).

Хотя изображения на рисунке 4 формировались одним и тем же числом пикселей и при одинаковых настройках фотоприёмника, наиболее ярким изображение митохондрий получилось при использовании объектива кратностью 40х (рисунок 4(а)). И напротив, объективы большего увеличения (60х — рисунок 4(b) и 100х — рисунок 4(с)) создавали всё более тёмное изображение (при увеличении 100х оно почти неразличимо). Последний объектив всё же можно использовать для наблюдения образца, но необходимо существенно увеличить усиление фотоприёмника, а это приведёт к ухудшению отношения сигнал-шум и снижению качества снимка. Следует заметить, что значения разрешающей способности объективов (рисунок 4(d) — (f)) сравнимы из-за одинаковых значений числовой апертуры.

Одним из основных выводов, которые следует сделать из снимков на рисунке 4, является необходимость избегать чрезмерного увеличения при выборе объектива для наблюдения флуоресцентных белков (и, собственно говоря, других флуророфоров). Простым цифровым увеличением (трансфокацией) при формировании изображения на конфокальном микроскопе с объективом 40х можно получить снимок, эквивалентный по масштабу тому, который был получен с помощью объектива 100х (рисунок 4(d) (f)). Разрешающая способность обоих объективов одинакова, поскольку равны их числовые апертуры. Тем не менее, не следует думать, что применение объективов 60х и 100х вообще не имеет никаких преимуществ. На самом деле, объективы с высокой кратностью увеличения часто необходимы при наблюдении широкопольными микроскопами очень малых объектов, таких как пероксисомы или секреторные гранулы. Поскольку от отношения размера изображения к размеру фотоприёмника зависит частота пространственной дискретизации, оптимальное увеличение определяется параметрами цифровой камеры (размером пикселя ПЗС и промежуточной кратностью увеличения). Таким образом, выбор объектива зависит не только от специфических требований отдельного эксперимента, но и от оптической конфигурации измерительного прибора.

Высоко скорректированные объективы (апохроматы) необходимо применять с осторожностью, и если можно обойтись без них, лучше их не использовать. Повышение оптической коррекции (например, от флюоритового объектива к апохромату) хроматической аберрации и плоскостности поля требует установки дополнительных линз. Каждая дополнительная линза ведёт к общему падению пропускания света через объектив, то есть к уменьшению сигнала, достигающего фотоприёмника. Хотя высоко скорректированные линзы необходимы для отдельных приложений, таких как мультиокрашенная визуализация, при их использовании сложнее добиться высокого отношения сигнал-шум (а значит и высокого качества изображения), особенно при наблюдении димерных флуоресцентных белков, таких как HcКрасный или ECFP. Суммируя вышесказанное, можно заключить, что флюоритовый объектив 40х (числовая апертура 1,3) предпочтительнее для наблюдения образцов, окрашенных одним флуоресцентным белком, но в экспериментах с мультиокрашенными образцами (два или более флуоресцентных белка) необходим апохроматический объектив, обеспечивающий коррекцию цвета.

Формирование многоцветных изображений флуоресцентными белками

Главной причиной появления многоцветной палитры флуоресцентных белков является стремление одновременно отслеживать сразу несколько происходящих в клетке явлений. Учитывая постоянно растущее число вариантов флуоресцентных белков (см. таблицу 1), следует заметить, что процесс их комбинирования уже не столь очевиден. При планировании экспериментов по наблюдению живых клеток с применением двух или более красителей одновременно, необходимо учитывать ширину спектральных профилей возбуждения и испускания, демонстрируемых флуоресцентными белками и их смещёнными по цвету генетическими вариантами. Особое внимание необходимо уделять возможным артефактам, связанным с проступанием (то есть «перетеканием» флуоресценции из канала одного красителя в канал другого), что является следствием значительного перекрывания спектров при комбинировании флуоресцентных белков.

Проступание (часто называемое захлёстыванием или перетеканием) может возникнуть как при возбуждении различных флуоресцентных белков, так и при их свечении. При исследовании свойств флуоресцентных красителей оказалось, что проступание возникает ближе к синему концу спектра (короткие волны), в то время как артефакты наиболее резко выражены в красном конце (длинные волны) при испускании. Например, зелёный флуоресцентный белок часто можно обнаружить через красные эмиссионные фильтры, но красный флуоресцентный белок через зелёные фильтры обычно не виден. По этой причине, при формировании многоцветных изображений флуоресцентных белков в первую очередь необходимо визуализировать зонды с наибольшей длиной волны испускания, возбуждая их на длинах волн, не «заезжающих» на спектры коротковолновых красителей. Например, при наблюдении EYFP и EGFP в одной и той же клетке с применением аргонового ионного лазера, первым должен собираться сигнал от возбуждения EYFP на линии 514 нанометров, лежащей вне профиля поглощения EGFP, с помощью эмиссионного фильтра с полосой пропускания 530–550 нанометров. Ширина полосы эмиссионного фильтра не особенно критична, если возбуждается только EYFP. Во втором цикле сканирования наблюдается EGFP. Он возбуждается на 477-нанометровой линии аргонового ионного лазера и высвечивает через эмиссионный фильтр с очень узкой полосой между 490 и 500 нанометрами. Этот фильтр должен быть правильно расположен, чтобы исключить флуоресценцию от EYFP и, в то же время, уловить сигналы от EGFP (довольно утомительное занятие). Хотя 488-нанометровый пик аргонового ионного лазера лежит ближе к максимуму возбуждения EGFP, он всё же слишком близок к полосе пропускания эмиссионного фильтра, что не исключает возможности интерференции отражённого лазерного луча и флуоресцентных сигналов.

Рис. 5. Формирование многоцветных изображений флуоресцентными белками

При формировании многоцветных изображений с применением двух или более флуоресцентных белков необходимо уделять должное внимание контролю проступания флуоресценции с помощью продуманного подбора фильтров. Следует, однако, заметить, что существенное урезание полосы пропускания фильтра возможно лишь за счёт отношения сигнал-шум (поскольку её шириной, в частности, и определяется количество собираемого сигнала) и временно?го разрешения, связанного с необходимым разделением приёма сигналов во времени. Необходимо также иметь в виду, что для оптимальных условий визуализации часто могут потребоваться специальные оптические конфигурации для каждого отдельного эксперимента. Например, для визуализации вариантов зелёных флуоресцентных белков в присутствии жёлтых дериватов необходимы комбинации фильтров, довольно специальные для стандартных конфокальных микроскопов. Поскольку количество флуоресцентных белков с различными спектральными профилями продолжает расти, будет расти и необходимость в специфических комбинациях фильтров.

На рисунке 5 представлена серия снимков клеточных линий, одновременно трансфектированных двумя или более флуоресцентными белками, слитыми с субклеточными мишенями. Клетки HeLa, представленные на рисунке 5(а), были окрашены зондами EYFP (ядро), ECFP (Гольджи) и DsRed2FP (митохондрии). Все три зонда чётко разделены широкопольными комбинациями флуоресцентных фильтров компании Nikon (CFP, YFP, HYQ и CY3 HYQ).

Эпителиальные клетки почки опоссума (OK линия), трансфектированные белками EGFP (тубулин), ECFP (ядро) и DsRed2FP (митохондрии) и наблюдаемые с помощью стандартных комбинаций фильтров, представлены на рисунке 5(b). Аналогично, на рисунке 5(с) представлены клетки почки кролика (RK-13 линия), трансфектированные белками EYFP (эндоплазматическая сеть) и ECFP (пероксисомы) и визуализированные с применением фильтрационных блоков CFP и YFP HYQ компании Nikon. Клетки африканского водяного мангуста (APM), представленные на рисунке 5(d), были трансфектированы белками EGFP (тубулин) и DsRed2FP (ядро), а клетки остеосаркомы человека (U2OS линия; рисунок 5(е)) были окрашены тем же красителем ядра наряду с белком ECFP (митохондрии). И, наконец, клетки почки детёныша хомяка (клеточная линия BHK), представленные на рисунке 5(f), были трансфектированы белками EGFP (пероксисомы) и DsRed2FP (митохондрии). Все снимки, представленные на рисунке 5, были получены широкопольным флуоресцентным микроскопом в сочетании с комбинациями фильтров Nikon, оптимизированными для соответствующих флуоресцентных белков.

Хотя самыми яркими флуоресцентными белками являются зелёные и жёлтые белки (см. таблицу 1), их спектральные максимумы разделены всего 20–25 нанометрами. Эксперименты по мультиокрашиванию комбинированием зелёных и жёлтых флуоресцентных белков возможны, но при этом серьёзной проблемой становится проступание между комбинациями фильтров Как следствие, зелёные и жёлтые белки обычно не используются вместе. Одной из наиболее популяных пар красителей является комбинация голубого и жёлтого флуоресцентного белка (ECFP и EYFP, см. рисунок 5). Хотя ECFP не намного ярче EBFP, у него есть два преимущества: он эффективно возбуждается на 457-нанометровой линии аргонового ионного лазера и не так быстро фотообесцвечивается (как показано на рисунке 2).

Объединение дериватов DsКрасного с зелёными или жёлтыми флуоресцентными белками является хорошей комбинацией, поскольку спектры испускания этих красителей легко разделяются. Тем не менее, к выбору вариантов DsКрасного необходимо относиться с должным вниманием из-за их разных сроков созревания. Более того, поскольку DsКрасный и его дериваты образуют облигатные тетрамеры in vivo, их применение может быть причиной нежелатльных воздействий на биологию белковых систем (скопление и локализация вокруг органелл, не исследуемых в данном эксперименте). К сожалению, не существует достоверного эмпирического правила для предсказания эффективности дериватов DsКрасного в качестве гибридных меток, к тому же, некоторые белки переносят олигомеризацию, а другие нет. Для тройного окрашивания с применением только флуоресцентных белков (рисунок 5(а) и 5(b)) комбинация голубого, жёлтого (или зелёного) и DsКрасного является превосходным решением.

При формировании изображений живых клеток двумя или более флуоресцентными белками неизбежно приходится идти на определённые компромиссы. Например, скорость сбора информации падает каждый раз при добавлении цвета, поскольку каждый краситель требует своих условий формирования изображения. Всё труднее становится контролировать проступание флуоресценции, особенно потому, что спектральные профили флуоресцентных белков имеют тенденцию к уширению (а часто и перекрыванию). К тому же, поскольку популярные флуоресцентные белки отличаются относительной яркостью (таблица 1), для каждого цвета может требоваться своё время интегрирования сигналов. Голубые и синие флуоресцентные белки довольно тусклые и могут требовать больше времени для собирания идущих от них сигналов, что ведёт к насыщению более ярких зелёных и жёлтых флуоресцентных белков. Поэтому при выборе флуоресцентных белков важно найти баланс между параметрами эксперимента (по сути, между скоростью формирования изображения и оптимальным разделением цветов). Например, для быстрого и эффективного формирования изображения хорошим выбором является комбинация EYFP и DsКрасного, поскольку для этих флуоресцентных белков можно использовать одинаковые настройки возбуждения, в то время как применение ECFP и EYFP может обеспечить высокую степень спектрального разделения.

Заключение

Совокупность доступных сегодня флуоресцентных белков и средств визуализации позволяет специалисту клеточной биологии эффективно отслеживать динамику белков в живых клетках и достигать новых уровней изучения поведения белков, органелл и самих клеток. Эти замечательные красители открыли новую эру в клеточной биологии, где с применением стационарных и кинетических микроскопических методов расшифровываются сложные биологические процессы. Благодаря быстрому развитию микроскопических систем для наблюдения живых клеток, включая основанные на эмиссии вторичных электронов ПЗС камеры, работающие в условиях низкой освещённости, конфокальные приборы с вращающимися дисками и сканирующие микроскопы со щелевой диафрагмой, стало возможным наблюдение флуоресцентных белков и оптических маркеров во всём видимом и ближнем инфракрасном диапазоне практически в реальном времени.