Конфокальная микроскопия (Часть 3)

Оптическая аберрация и выбор объектива в многоцветной конфокальной микроскопии

Усовершенствования в конструкции упростили конфокальную микроскопию до того, что она стала стандартным инструментом исследования в клеточной биологии. Тем не менее, поскольку конфокальные микроскопы стали более мощными, они стали более требовательными к оптическим компонентам. На самом деле, оптические аберрации, вызывающие несущественные дефекты изображения в широкопольной микроскопии, могут иметь разрушительные последствия в конфокальной микроскопии. К сожалению, строгие оптические требования конфокальной микроскопии часто «скрыты» оптическими системами, гарантирующими четкое изображение с высоким разрешением даже на слабом микроскопе. Производители оптики предлагают широкий выбор объективов для микроскопов, каждый для определенного применения. В этой работе показано, как плюсы и минусы в конструкции этих объективов могут повлиять на наблюдения в конфокальной микроскопии.

Рис. 1. Хроматическая аберрация двух объективов

Еще 10 лет назад конфокальные микроскопы были техникой, предназначенной для узкого круга специалистов, а сегодня это стандартный исследовательский инструмент. Его распространенность стала результатом, как быстрого развития технологий в конфокальной микроскопии, так и детально проработанного пользовательского интерфейса коммерческих конфокальных микроскопов. Новейшие системы практически являются системами «под ключ», с помощью которых даже начинающий микроскопист может быстро получать снимки высокого качества. Как ни странно, но именно те технические достижения, которые стали причиной распространения конфокальной микроскопии в экспериментальной биологии, привели к ограничениям на оптические элементы конфокальных микроскопов, понимание оптических свойств которых стало сегодня важным, как никогда ранее.

Наиболее распространенным приложением конфокальной микроскопии является сравнение распределения или «поведения» многих зондов в одних и тех же клетках. Такие исследования стали возможными благодаря способности конфокальных микроскопов эффективно наблюдать многоцветную флуоресценцию и получению красителей с расширенным для конфокальной микроскопии спектром. В зависимости от конфигурации микроскопа, для таких исследований может потребоваться оптика, работающая в диапазоне от ультрафиолетовых до инфракрасных волн. Требования точной цветной визуализации еще больше возросли с развитием колориметрических методов количественной микроскопии, таких как измерения относительной флуоресценции в концентрациях ионов.

Избавление от хроматическай аберрации — это только одна из задач, стоящих перед разработчиками оптики, помимо которой существуют еще монохроматические аберрации, высокий квантовый выход, размер поля, его плоскостность, рабочее расстояние и возможность создания изображений глубоких слоев водянистых биологических тканей. Поскольку конструкция оптики микроскопов это результат компромиссов различных параметров, перечисленных выше, производители обычно предлагают ряд объективов, каждый со своим набором компромиссных решений, и пригодных для определенных приложений. В настоящей статье показывается, что выбор объектива микроскопа может иметь влияние на результаты экспериментов конфокальной микроскопии. В ней подчеркивается важность тщательного выбора объектива микроскопа, подходящего именно для данного эксперимента.

Идеальный объектив фокусирует все цвета света в одну точку. В действительности все линзы имеют хроматическую аберрацию, свойство, благодаря которому различные цвета света фокусируются в разные точки. Результатом этого явления оказываются окрашенные края, возникающие при наблюдении образца в окуляр микроскопа. При наблюдении образца в цветной конфокальной микроскопии этот дефект приводит к тому, что возбуждающее освещение различного цвета фокусируется на разных точках образца, и разные цвета света испускания собираются тоже из разных точек образца. Горизонтальный сдвиг в плоскости изображения, называемый поперечной хроматической аберрацией, приводит к различному увеличению различных цветов. Эту проблему можно минимизировать сокращением области анализа к центру поля зрения микроскопа. Тем не менее, вертикальное смещение цвета вдоль фокальной оси, называемое продольной хроматической аберрацией, происходит вне поля микроскопа. Это, действительно, проблема для исследователя, определяющего с помощью конфокальной микроскопии относительное распределение множественных зондов. Снимки, представленные на рисунках 1–3, показывают, какое существенное влияние на конфокальное изображение оказывает выбор объектива микроскопа.

На снимках сравниваются результаты наблюдений план-флюоритовым объективом 40x, созданным для максимального пропускания УФ света, с планапохроматическим объективом 100x, разработанным с минимальной хроматической аберрацией. В одном случае наблюдался свет, отраженный от поверхности покровного стекла. Была получена вертикальная серия изображений на длинах волн 488 и 647 нанометров. Если свет разного цвета отражается от одной поверхности, линза без хроматической аберрации сфокусирует различные цвета в одной фокальной плоскости. В вертикальном поперечном разрезе изображения, полученные идеальным объективом, представляли бы одну горизонтальную линию, в которой цвета полностью перекрывают друг друга. Снимки в верхней половине рисунка 1(a) представляют xz-сечения поверхности покровного стекла в отраженном свете с фокальной осью (z), ориентированной вертикально. Из них видно, что планапохроматический объектив 100x создает изображение, довольно близкое к идеалу, со смещением цветов примерно на один микрометр. И напротив, план-флюоритовый объектив 40x регистрирует отраженный свет с длиной волны 647 нанометров примерно на 1,2 микрометра выше, чем свет с длиной волны 488 нанометров. На этих снимках, излучение с длиной волны 647 нанометров показано красным, а излучение с длиной волны 488 нанометров — синим. Цена деления масштабной линейки — 1 микрометр.

Рис. 2. Коррекция продольной хроматической аберрации

Это явление вертикального смещения явно наблюдается при флуоресценции. В нижней половине рисунка 1(a) представлены вертикальные сечения изображений гранул, помеченных тремя флуорофорами. При наблюдении планапохроматическим объективом 100x, три цвета совпадают, образуя белое, почти круглое пятно. Напротив, объектив с увеличением 40x создает изображение, в котором дальняя красная флуоресценция (испускание на 680 нанометров, изображенное синим) явно вертикально смещена от красной (600 нанометров) и зеленой (520 нанометров) флуоресценции. В дополнение, небольшое горизонтальное смещение дальней красной флуоресценции отражает поперечную хроматическую аберрацию.

При проведении тестов с биологическим образцом был использован тот факт, что эндосомы могут быть помечены инкубируемыми клетками с флуоресцентно окрашенными эндоцитозными лигандами. Большое число молекул, включенных в каждую эндосому, гарантировало одинаковую долю флуоресцентных зондов в каждой из них. Таким образом, эндосомы представляют превосходный материал для тестирования цветной конфокальной микроскопии, поскольку, являясь по размеру неразличимыми для микроскопа, они флуоресцируют, и по этому свечению можно определить относительный вклад каждого флуорофора во флуоресцентное свечение. На рисунке 1(b) показано цветное изображение клеток, в которых эндосомы были помечены как флуоресцеиновым трансферрином (F-Tf, флуоресцирует зеленым), так и Cy5- трансферрином (Cy5-Tf, флуоресцирует дальним красным), полученное с помощью планапохроматического объектива 100x. Совпадение двух зондов очевидно в постоянных оранжево-желтых цветах отдельных эндосом, и еще более очевидно при сравнении снимков большего увеличения: F-Tf (рисунок 1(с)) и Cy5-Tf (рисунок 1(d)). Масштаб снимков 1(b) — 1(d) — 10 микрометров.

При наблюдении через план-флюоритовый объектив 40x, тем не менее, заметно небольшое смещение фокальных плоскостей даже между красной и зеленой флуоресценцией, как это видно в клетках, меченных Tf, соединенных с флуоресцеином и с родамином (рисунок 2(a)). Смещение фокальных плоскостей дальней красной и зеленой флуоресценции привело к поразительной разнице в видимом распределении F-Tf и Cy5-Tf, которое теперь оказывается совершенно различным (рисунок 2(b)).

Для специалиста по клеточной биологии, оценивающего относительное распределение различных зондов, такое смещение будет иметь катастрофические последствия. Сдвиг фокальных плоскостей может быть преодолен проецированием всей вертикальной серии по объему образца в одну проекцию, что устраняет эффект от разницы фокальных плоскостей для двух цветов (рисунок 2(с)). Постоянный желтый цвет каждой эндосомы в проекции говорит о равномерном распределении двух зондов в каждой эндосоме. Однако, поскольку эта процедура стирает всю «вертикальную» информацию, ей редко пользуются в представлении конфокальных изображений. Эффекты продольной хроматической аберрации могут быть также минимизированы измерением осевого смещения по различным цветам и объединением изображений, полученных из фокальных плоскостей, соответствующих каждая своему цвету. Результат этой процедуры — объединенное изображение зеленого и дальнего красного снимков, полученное план-флюоритовым объективом 40x из фокальных плоскостей, находящихся на расстоянии 1,2 микрометра — представлен на рисунке 2(d). Цена деления масштабной линейки на рисунках 2 — 10 микрометров. Коррекция, достигаемая объединением изображений, полученных из разных фокальных областей, очевидная при сравнении изображений отдельных зондов, показана на рисунке 3. В то время как на рисунках 3(a) и 3(b) нет признаков удовлетворительного соответствия распределений F-Tf и Cy5-Tf (при наблюдении в одной фокальной плоскости), сравнение рисунков 3(b) и 3(с) показывает, что изображение в дальнем красном цвете может быть наложено на изображение в зеленом свечении, полученном на 1,2 микрометра ниже. Цена деления масштабной линейки на рисунках 3(a) -3(с) 5 микрометров.

В то время как хроматическая аберрация приводит к тому, что свет различного цвета фокусируется в различных точках объемного изображения, сферическая аберрация может значительно ослабить сигнал в конфокальном микроскопе. Линза со сферической аберрацией фокусирует осевые и периферийные лучи в разные точки, размывая тем самым изображение точечного источника излучения. Конфокальная точечная диафрагма эффективно сокращает искажающую флуоресценцию объекта, наблюдаемого объективом со сферической аберрацией тем же образом, которым она отсекает внефокусное свечение, существенно улучшая при этом контрастность изображения.

Рис. 3. Цветовая коррекция фокальных плоскостей

Для многих образцов первичной причиной сферической аберрации является разница между показателями преломления иммерсионной среды и среды для заливки. До недавних пор объективы микроскопов с самым высоким разрешением и с лучшей коррекцией аберрации разрабатывались под использование масла в качестве иммерсионной среды. Для этих объективов сферическая аберрация минимизируется только при условии, что весь оптический путь имеет показатель преломления иммерсионного масла (который совпадает с показателем преломления стекла и накапливается при прохождении света через среды с различным показателем преломления. Поскольку большинство образцов, особенно живых, заливается средой с показателем преломления, существенно ниже иммерсионного масла, сферическая аберрация, таким образом, ограничивает глубину наблюдения при использовании иммерсионных объективов.

На рисунке 4 продемонстрированы эффекты сферической аберрации в конфокальной микроскопии, когда масляно-иммерсионным объективом были получены изображения клеток, помеченных F-Tf и погруженных на глубину либо 0 микрометров (поверхность покровного стекла) (рисунок 4(a)), либо 35 микрометров в водную среду (рисунок 4(b)). В обоих случаях эндосомы ясно видны, но сферическая аберрация, накопленная при прохождении светом 35 микрон водной среды, значительно ослабила флуоресцентный сигнал (рисунок 4(b). Цена деления на всех рисунках 4 равна 10 микрометрам.

Недавно производители оптики попытались решить эту проблему, разработав объективы, использующих воду в качестве иммерсионной среды. При наблюдении образцов в водной среде, совпадение показателей преломления иммерсионной среды и среды для заливки приводит к тому что сферическая аберрация не зависит от глубины наблюдения. Это позволяет таким объективам получать изображения на любой глубине в образце, в пределах рабочего расстояния. Успех такого подхода показан на рисунках 4 ((с) и (d)), где клетки, окрашенные F-Tf, сняты водно-иммерсионным планапохроматическим объективом 60x на нулевой глубине (рисунок 4(с)), и на глубине 66 микрометров водной среды (рисунок 4(d)). В этом случае флуоресцентный сигнал не зависит от светового пути в водной среде образца. Это новое поколение планапохроматических водно-иммерсионных объективов с высокой числовой апертурой существенно помогло конфокальной микроскопии реализовать ее потенциал в трехмерной визуализации биологических структур.

Хроматическая аберрация этих водно-иммерсионных объективов лежит между масляно-иммерсионнымиплан-флюоритовым и планапохроматическими объективами, обсуждавшимися выше. Поперечные сечения пучков, отраженных от стеклянной поверхности, представленные в верхней половине рисунка 5 (a), показывают, что свет с длиной волны 647 нанометров фокусируется примерно на 0,6 микрометров выше света с длиной волны 488 нанометров. Совпадение результатов, полученных для образцов в водной среде на глубине 0 и 63 микрометра, говорит о независимости этого сдвига от глубины наблюдения.

В нижней левой части рисунка 5 (a) показан результат цветового сдвига при наблюдении гранулы, меченной тремя метками: изображение в дальнем красном цвете отстоит от красного и зеленого флуоресцентных изображений. Во флуоресцентных изображениях гранулы, испускание на 520 нанометрах показано в зеленом цвете, на 600 нанометрах — в красном, а на 680 нанометрах (дальний красный) — в синем. Критическое значение коррекции толщины покровного стекла, как параметра, влияющего на минимизацию сферической аберрации в объективах этого типа, показано в правой нижней части рисунка. Поскольку коррекция сферической аберрации зависит от длины оптического пути сквозь покровное стекло, ее можно регулировать, выставляя регулировочное кольцо объектива в соответствующее положение в зависимости от толщины покровного стекла. В левой части рисунка поперечное изображение гранулы было получено с регулировочным кольцом, установленным в положение, соответствующее измеренной толщине покровного стекла (174 микрометра), справа же оно было выставлено неверно — для толщины 150 микрометров. Сферическая аберрация, вызванная неправильной установкой регулировочного кольца, катастрофически снизила флуоресцентный сигнал и ухудшила разрешающую способность по вертикали. Хотя неправильное значение было выставлено намеренно, для усиления эффекта, необходимо подчеркнуть, что такие ошибки встречаются на практике довольно часто, поскольку действительная толщина покровного стекла может меняться в пределах 40 микрометров от своего номинального значения. Правильное положение регулировочного кольца можно гарантировать только после измерения толщины данного покровного стекла. На всех снимках рисунка 5(a) фокальная ось вертикальна и цена деления — 1 микрометр.

Рис. 4. Эффекты сферической аберрации в конфокальной микроскопии

На рисунке 5 (b) и рисунке 5 (с) показаны клетки, окрашенные F-Tf и Cy5-Tf. Снимки были получены на глубине 63 микрометра водного буфера. Цена деления — 10 микрометров. Хотя снимки выглядят резкими, продольная хроматическая аберрация объектива приводит к тому, что распределения F-Tf и Cy5-Tf кажутся обособленными (рисунок 5 (b)). Тем не менее, проекция вертикальной серии снимков этих клеток (рисунок 5 (с)) показывает, что два зонда равномерно распределены по всем эндосомам. В соответствии с изображениями, полученными в отраженном свете на рисунке 5(a), продольная хроматическая аберрация подобным же образом проявляется и в изображениях эндосом, полученных на нулевой глубине (на поверхности покровного стекла). Небольшое отличие наблюдается в фокальной плоскости красной и зеленой флуоресценции в изображении эндосом, помеченных Tf, соединенным с флуоресцеином и родамином (рисунок 6 (a)), но зонды F-Tf и Cy5-Tf, вновь высвечивают разные популяции эндосом (рисунок 6 (b)).

Возможно, провести сравнение распределений двух зондов будет лучше, если допустить разность распределения точек в фокальной плоскости и объединить изображение Cy5-Tf с изображением флуоресцеина, полученным на 0,6 микрометров глубже. Совпадение двух зондов теперь очевидно в постоянном желтом цвете эндосом на рисунке 6 ©. Явная разность распределения двух зондов на изображениях, полученных в одной фокальной плоскости (рисунок 6(d) и рисунок 6(e)), исчезает, когда изображение Cy5-Tf сравнивается с изображением F-Tf, полученным на 0,6 микрометров ниже (рисунок 6 (f)). Масштабное деление на рисунках 6 (a) — 6 (с) 10 микрометров, а на рисунках 6 (d) — 6 (f) — 5 микрометров.

Количественная оценка эффекта хроматической аберрации может быть выполнена посредством измерения коэффициента флуоресценции в изображениях эндосом, помеченных многими метками. Полулогарифмические графики распределения этих отношений представлены на рисунке 7(a) для клеток, помеченных зондами F-R-Tf и наблюдаемыми планахроматическим объективом 100x (красная кривая), планфлюоритовым объективом 40x (голубая кривая) и водно-иммерсионнымплан-ахроматическим объективом 60x (зеленая кривая). На рисунке 7(b) представлены графики коэффициента флуоресценции для клеток, помеченных F-Tf и Cy5-Tf, полученные с помощью тех же трех объективов. На рисунке 7 (a) видно, что отношение свечения родамина к флуоресцеину (красного к зеленому) достаточно постоянно для всех трех объективов. Напротив, из графиков на рисунке 7 (b) следует, что, в то время как планахромат 100x демонстрирует минимальные изменения отношения Cy5 к флуоресцеину (дальнего красного к зеленому), водно-иммерсионный планахромат 60x показывает большие отклонения, а план-флюорит 40x еще большие. Эффекты хроматической аберрации при наблюдении планахроматом 60x и план-флюоритом 40x еще более очевидны, когда распределения, полученные для одной фокальной плоскости сравниваются с распределениями в проекции вертикальной серии для каждого объектива (рисунок 7 © и 7 (d), соответственно). Близкие для каждого объектива отношения флуоресцентного свечения в проекционных снимках говорят о равномерном распределении двух зондов в эндосомах, чего нельзя сказать о снимках, сделанных в одной фокальной плоскости.

Рис. 5. Клетки, окрашенные F-Tf и Cy5-Tf 

Представленная работа наглядно демонстрирует, как хроматические и сферические аберрации ухудшают конфокальную визуализацию. В то же самое время, она подчеркивает критическое значение выбора объектива в конфокальной микроскопии. Недостаточная коррекция цвета приводит к ошибочной интерпретации относительных распределений множественных зондов — одного из главных приложений конфокальной микроскопии. Оценка соотношений также показывает, как хроматическая аберрация снижает количественный анализ с помощью микроскопа. Сферическая аберрация, возникающая из-за несоответствия иммерсионной среды и среды заливки, не только ухудшает продольное разрешение, но может свести на нет и детектирование самой флуоресценции. Хотя эти дефекты особенно заметны в высококонтрастных конфокальных изображениях, они могут ухудшать снимки, полученные традиционными эпифлуоресцентными и трансиллюминационными методами. Первоначально под хроматической аберрацией подразумевалась аберрация при наблюдении UV флуорофоров. Но новые эксперименты говорят о значительной хроматической аберрации и в дальнем красном диапазоне, который, с появлением новых зондов дальней красной области спектра и лазеров, способных их возбуждать, становится все более привлекательным для микроскопистов Хотя в данных исследованиях рассматриваются только точечные источники, полученные выводы справедливы (но необязательно очевидны) и для зондов более дальних областей. К таким зондам относится цитозольный краситель, который часто используется в измерениях относительной флуоресценции в ионных концентрациях.

Например, флуоресценция цитозольного pH индикатора SNARF-1 возбуждается светом длины волны 488 нанометров, а pH измеряется по отношению флуоресценции на 580 нанометрах к флуоресценции на 640 нанометрах. Нетрудно представить, как при измерениях цитозольного pH индикатора в тонких клетках, отношение флуоресценции будет зависеть от положения клетки по отношению к отстоящим друг от друга фокальным плоскостям зеленого света возбуждения, красного и дальнего красного света испускания. Хотя, обычно, из-за этих ошибок возникают просто дополнительные отклонения в измерениях (удвоение или утроение стандартных отклонений в представленных оценках), они также могут систематически влиять на измерения соотношений, например при измерении относительных концентраций в различных частях клеток с переменной толщиной.

Рис. 6. Продольная хроматическая аберрация в водно-иммерсионных объективах

Еще одним следствием хроматической аберрации, хоть и не обсуждаемым здесь, является ее влияние на прием флуоресцентного сигнала. В конфокальных системах с хроматической аберрацией разность длин волн возбуждения и испускания приводит к возбуждению одного объема, а получению изображения другого объема, что ослабляет сигнал.флуоресценции Для систем сканирования луча (большинство конфокальных микроскопов), потеря сигнала увеличивается с расстоянием от оси, при удалении фокусного пятна от конфокальной точечной диафрагмы.

Необходимо подчеркнуть, что полученные выводы относятся не только к объективам, использованным в описанных экспериментах, и не к отдельным производителям. Классификация цветовой коррекции была точно воспроизведена в трех примерах — при наблюдении тремя водно-иммерсионными объективами 60x, двумя масляно-иммерсионными объективами 100x, на микроскопах Quantum и Diaphot. Было выявлено, что объективы всех основных производителей имеют значительную продольную хроматическую аберрацию. В действительности, распространенность хроматической аберрации привела к развитию микроскопов альтернативных конструкций, в которых хроматическая аберрация либо сводится к минимуму за счет применения специальных вспомогательных корректирующих линз, либо вообще используются зеркальные объективы, без преломления. Тем не менее, оптика микроскопов, вероятнее всего продолжит развиваться и первый опыт использования нового поколения оптики CFI60 компании Nikon, Inc. свидетельствует, что коррекция продольных хроматических аберраций значительно улучшилась.

На первый взгляд может показаться, что одни объективы лучше других. Тем не менее, как уже говорилось ранее, конструкция объектива представляет собой компромисс конструктивных параметров. А раз так, каждый объектив — это набор компромиссных решений, предназначенный для определенного приложения. Однако, возможна такая ситуация, когда эксперимент придется подстраивать и подгонять под возможности существующей оптики за неимением конструктивных решений, способных удовлетворить потребности исследователей.

Если масляно-иммерсионный объектив должен быть использован для наблюдения образца в водной среде — например при изучении живых клеток — сферическая аберрация может быть уменьшена либо за счет минимизации оптического хода лучей через водную среду, либо за счет использования масла с показателем преломления, подобранным под сферическую аберрацию, возникающую на оптическом пути через воду.

Рис. 7. Количественный анализ и хроматическая аберрация

Хроматическая аберрация может быть минимизирована несколькими способами. Если в каком-то эксперименте требуется использование объектива со значительной хроматической аберрацией, наиболее очевидное решениеизбегать красителей с дальней красной флуоресценцией, таких как все Cy5. Из результатов, приведенных в этом обзоре, видно, что все тестируемые объективы дают удовлетворительное соответствие при наблюдении зеленой и красной флуоресценции. В общем, лучше всего использовать красители с длиной волны возбуждения и испускания, максимально близкой к той, для которой он был откорректирован. Второе решение, рассмотренное выше — получить вертикальную серию изображений каждого флуорофора в фокальных плоскостях и объединить изображения различных цветов, учитывая расстояние между фокальными плоскостями. Это простое решение, но оно не годится, когда необходима быстрая визуализация, например живых клеток. Результаты анализ, не приведенные здесь, показывают, что это решение не дает достаточной точности при коррекции изображений, предназначенных для количественных измерений. Более дорогой (или менее распространенный) способ — использовать двухфотонную микроскопию, которая, по сути, лишена хроматической аберрации, если в схеме отсутствует точечная диафрагма. Однако ее многоцветные возможности стали исследоваться только сейчас.

Методы и приложения трехцветной визуализации в лазерной сканирующей конфокальной микроскопии

Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп (ЛСКМ) регулярно используется для получения цифровых изображений флуоресцентных образцов, помеченных одной, двумя и тремя метками. Использование красного, зеленого и синего (RGB) цветов наиболее информативно при демонстрации распределения до трех флуоресцентных зондов, метящих клетку, где любое совпадение наблюдается, как добавление дополнительного цвета в трехцветном изображении, полученном в результате слияния изображений в единое целое.

Рис. 1. Объединённые трёхцветные изображения

В этом разделе рассматривается упрощенная версия ранее опубликованного метода получения трехцветного изображения с помощью популярной программы обработки изображений Adobe Photoshop. Дополнительно, обсуждаются несколько приложений для слияния отдельных сканируемых изображений в единое трехцветное изображение для демонстрации конфокальных снимков. Следует заметить, что эти методы не ограничены изображениями, полученными с помощью ЛСКМ, и применимы к изображениям, импортированным в Photoshop из различных источников.

Изображения флуоресцентно-окрашенных образцов были получены на лазерной сканирующей конфокальной системе Bio-Rad Model MRC-600 с применением методов, ранее описанных в литературе. Из компьютера конфокального микроскопа отобранные изображения были направлены на второй компьютер в виде двоичных файлов. Изображения импортировались прямо в Adobe Photoshop, либо в виде обыкновенных двоичных файлов (RAW), либо в виде файлов изображений в теговом формате (TIFF). В случае файлов в формате RAW необходимо вводить действительные размеры конфокальных изображений; например типичный размер изображения 768×512 пикселей с 76-байтным заголовком. Заголовок специфичен и записан компанией Bio-Rad в собственном PIC формате, и может меняться в системах визуализации различных компаний. Эта информация о файлах изображений легко доступна и предоставляется каждым производителем конфокальных систем. Файлы TIFF, напротив, открываются прямо в Photoshop. При необходимости, файлы конфокальных изображений могут быть конвертированы в файлы TIFF с помощью имеющихся в продаже программ, написанных для обработки конфокальных снимков, или других программ, таких как NIH Image, которые можно скачать из Интернета. Существует много программ, полезных для дальнейшей обработки конфокальных снимков.

Рис. 2. Разноцветные каналы RGB изображения

Чтобы описанным методом слить два изображения, третий канал должен оставаться свободным. Ранние версии программы Photoshop требовали пустого или черного фонового изображения для третьего канала; при этом красное изображение помещалось в красный канал, зеленое — в зеленый, а пустое изображение — в синий канал RGB изображения для получения двойного красного/зеленого изображения. В версиях Photoshop 3.0.5 и выше два серых изображения могут быть вставлены в новое созданное черное RGB изображение. Например, для получения красно-зеленого изображения отдельные изображения вставляются в красный и зеленый каналы (рисунок 2 (a)).

Комбинация цветов в объединенном трехцветном изображении важна для передачи биологической информации, полученной конфокальным микроскопом. Действительные цвета испускания двух из наиболее часто используемых флуорофоров, родамина и флуоресцеина, красный и зеленый, соответственно, а перекрывающиеся домены изображаются желтым. Эти цвета наблюдаются визуально в традиционный эпифлуоресцентный микроскоп, с набором светофильтров для одновременной визуализации образца, окрашенного двумя метками. Сейчас это возможно на микроскопах большинства производителей. Примечательно, что третий флуорофор в образцах, окрашенных тремя метками и приготовленных для конфокального анализа, обычно испускает в дальнем красном; например цианин-5 (Cy5) в цифровых изображениях для удобства представлен синим, в то время как в действительности его свечение чрезвычайно трудно заметить глазом и нелегко отобразить на цифровом изображении.

Этот метод слияния конфокальных изображений широко используется для отображения распределения макромолекул в образцах, меченных двумя и тремя метками. Из-за исключительной специфичности иммунофлуоресценции многие изображения, представленные только в оттенках серого, выглядят достаточно абстрактно и, очень часто, могут быть интерпретируемы только вместе со вторым или третьим изображением в ткани другого известного распределения. Это типично для ядер, помеченных флуоресцентной гибридизацией in-situ (FISH). Эти изображения часто состоят из нескольких ярких пикселей на почти черном фоне и могут быть интерпретированы, только когда второе, контрастно -окрашенное изображение с распределением ядер или хромосом, сливается с ярко окрашенными центрами гибридизации. Красители димерной нуклеиновой кислоты, такие как YOYO-1 (максимум возбуждения на 491 нанометрах) или TOTO-3 (максимум возбуждения 642 нанометрах) являются превосходными контрастными красителями для этих целей. Недавно, с использованием комбинаторной техники мечения на одной хромосоме удалось локализовать более, чем три зонда. В данном случае для отображения биологической информации в изображениях, были разработаны и использованы более сложные компьютерные методы слияния и анализа изображений.

Рис. 3. Привязка цвета к глубине

Конфокальная визуализация образцов, окрашенных многими метками, — это превосходный инструмент для биологов-онтогенетиков, изучающих последовательность развития клеточных поколений и анализирующих клоны, когда распределение одного, или иногда двух белков, может быть использовано в качестве ориентира при " нанесении на карту» третьего интересующего белка в развивающейся ткани. Более того, флуоресцентно-окрашенный фаллоидин является удобным зондом для включения в методику тройного мечения при визуализации контуров клеток. Специфическая комбинация красителей, например родамин-фаллоидина для мечения контуров клеток, TOTO-3 для мечения ядер (по каналу Cy5) и антитела к интересующему белку (по каналу флуоресцеина), может быть использована в методике тройного мечения для нанесения на карту положения белка по отношению к ядру, цитоплазме или внеклеточному матриксу.

В дополнение к отображению относительного распределения до трех различных макромолекул в пределах клетки, этот метод слияния трех изображений может быть использован как альтернатива трехмерной (3-D) реконструкции для исследования образца по глубине. С помощью ЛСКМ серия изображений из разных фокальных плоскостей в образце собирается в единый файл z-серии. В этих изображениях сохраняется направление осей x, y и z образца, и все они одинакового размера и пиксельного разрешения. Из такой z-серии выбираются три изображения, и тремя файлами (по одному в каждом) экспортируются в Photoshop, где сливаются, как было описано ранее, таким образом, что красный, зеленый и синий цвета приписываются структурам на разных глубинах образца (рисунок 3, (a) и (b)). Таким же образом монохромные изображения в течение трех различных моментов времени могут быть извлечены из файла, хранящего последовательность изображений, полученную в заданный временной интервал с помощью конфокального микроскопа, и слиты в единое трехцветное изображение. Эти файлы аналогичны z-серии, за исключением того, что время заменяет z-измерение. В этом случае различие цветов используется для суммирования происходящих со временем изменений в положении структур в монохромном изображении.

Изображение на рисунке 3(a) — это результат слияния трех изображений из z-серии, окрашенных таким образом, что определенный цвет приписывается определенной глубине в образце. Эпителиальные ядра показаны зеленым, а ядра клеток, формирующих чешуйки — синим и красным (на разных уровнях эпителия). В качестве образца взят тотальный препарат эпителия крыла куколки бабочки, окрашенный иодидом пропидия. На рисунке 3(b) различные структуры окрашены в зависимости от глубины. Здесь представлено двухцветное изображение тотального препарата эпителия крыла бабочки на более поздней, по сравнению с рисунком 3(a), стадии развития. В этом образце ядра помечены TOTO-3, а появляющиеся чешуйки крыльев, находящиеся в дорсальном положении — техасским красным фаллоидином.

Photoshop может также служить мостом к дальнейшей обработке изображений, поскольку эти файлы совместимы со многими другими программами. Например, последовательности конфокальных изображений, запечатлевших процесс развития, после обработки в Photoshop были смонтированы с помощью доступных для приобретения программ трансформации (морфинга) в короткие анимационные фильмы, демонстрирующие биологическое развитие. Эти фильмы в дальнейшем можно отредактировать и объединить с помощью программы Adobe Premiere и просмотреть, как цифровой фильм, с помощью Apple QuickTime прямо на вашем компьютере (можно использовать и другое приложение) или записать его на видеопленку, предназначенную, например, для презентации.

Photoshop может работать на различных компьютерных платформах и компьютерах большинства конфокальных микроскопов. Некоторые сложные системы конфокальной визуализации способны получать, объединять и раскрашивать три изображения одновременно, используя систему трех приемников, что может сделать ненужным использование Photoshop. И все же, для обработки конфокальных изображений часто необходим дополнительный лабораторный компьютер, позволяющий разгрузить конфокальную рабочую станцию для выполнения основной задачи — получения изображений. Более того, при окончательной обработке изображения может возникнуть необходимость объединить его с изображением, полученным из другого источника. В этой ситуации универсальность единой программы обработки изображений трудно переоценить.

Основы конфокальной отражательной микроскопии

Говоря о «конфокальной микроскопии», многие исследователи в области биомедицины подразумевают создание и визуализацию изображений в свете флуоресценции. Для этой, по-видимому, очевидной связи есть серьезные основания. Для создания улучшенных снимков мультиокрашенных клеток и тканей, в большинстве биомедицинских приложений конфокальной микроскопии используется ее возможность производить оптические срезы, в сочетании с тончайшей технологией иммунофлуоресценции или флуоресцентной гибридизации in-situ (FISH).

Рис. 1. Конфокальное изображение клеток на субстрате в отражённом свете

Конфокальная отражательная микроскопия может использоваться для сбора дополнительной информации об образце относительно легким способом, поскольку эта методика требует минимальной подготовки образца и перенастройки аппаратуры. К тому же, информация о неокрашенных тканях вполне доступна методами конфокальной отражательной микроскопии, так же как и данные о тканях, окрашенных метками, отражающими свет. Этот метод может быть также использован с более общими классическими методами исследований в свете флуоресценции. Примерами более поздних приложений являются обнаружение неокрашенных клеток в популяции флуоресцентно-окрашенных клеток и визуализация взаимодействий между флуоресцентно-окрашенными клетками, растущими на непрозрачном структурированном субстрате, как показано на рисунке 1.

На рисунке 1 (а) представлено полученное с помощью конфокальной отражательной микроскопии цифровое изображение глиальных клеток, растущих на кремниевой подложке, структурированной маленькими, высотой 1 микрометр, столбиками. Клетка иммунофлуоресцентно окрашена винкулином (красный) и глиальным фибриллярным кислым белком (GFAP, зеленый). На рисунке 1 (b) показаны нейроны, растущие на той же кремниевой подложке. Они мечены антителом к микротрубочному примесному белку 2 (MAP-2) и вторичным антителом, окрашенным флуоресцеином. Поверхность кремниевой подложки и в этом случае была визуализирована с помощью конфокальной отражательной микроскопии.

Основная привлекательность конфокальной отражательной микроскопии в биомедицине заключается в возможности создания изображений неокрашенных живых тканей. Эта методика, на самом деле, уже применялась для наблюдения различных тканей: кожной, костной, зубной, глазной и тканей головного мозга. Конфокальная отражательная микроскопия особенно хорошо работает при наблюдении роговицы и хрусталика глаза, поскольку они прозрачны. Например, с помощью водно-иммерсионных объективов с большим рабочим расстоянием были получены оптические срезы роговицы и хрусталика на глубине 400 микрометров.

Визуализация неокрашенных образцов с помощью конфокальной отражательной микроскопии была общепринятой для разработчиков ранних конфокальных приборов еще до появления эпифлуоресцентной методики. В конфокальном отражательном режиме могут работать и лазерный сканирующий конфокальный микроскоп (ЛСКМ), и микроскоп с вращающимися дисками Нипкова. Преимущество микроскопа с вращающимся диском состоит в том, что изображения можно получать в реальном времени, наблюдать в реальном цвете без отражательных артефактов, иногда присутствующих в ЛСКМ. Такие артефакты появляются в виде ярких пятен на изображении, вызванных отражением света от одного или более оптических элементов микроскопа. Существует несколько способов борьбы с артефактами в отражательной микроскопии. Например, сканирование участка образца вне оптической оси микроскопа и увеличение масштаба яркого пятна вне фрейма. Другим способом является «цифровое» вычитание изображения пятна при обработке снимка или коррекция плоскостности поля. Отражательные артефакты можно также исключить с помощью установки поляризационных светофильтров.

Традиционным биологическим приложением широкопольной визуализации в отражательном свете является наблюдение взаимодействий между клетками, растущими на тканевой культуре на покровном стекле. При этом используется техника интерференционной отражательной микроскопии. В экспериментах такого типа, сцепление (адгезия) клетки с субстратом видимо на поверхности соприкосновения покровного стекла и клеток под ним. Такие области клеточной адгезии продолжают представлять огромный интерес для исследователей. Белки, связанные с фокальными контактами анализируются по иммунофлуоресценции, а сами контакты могут наблюдаться с помощью интерференционной отражательной микроскопии.

Рис. 2. Интерференционное отражение в конфокальной отражательной микроскопии

Реакция адгезии клетки с субстратом наблюдаются аналогичным образом с помощью конфокальной отражательной микроскопии, что показано на рисунке 2. Здесь опять видна поверхность раздела покровного стекла и клетки. Ее бывает трудно заметить в конфокальной микроскопии, но покровное стекло с высокой отражательной способностью облегчает эту задачу при фокусировке. Граница раздела клетки с субстратом может быть локализована при фокусировке в режиме быстрого сканирования,. На снимке она находится сразу за покровным стеклом, изображенным в виде яркой вспышки, при проникновении в клеточные слои. При фокусировании таким способом важно не перегрузить фотоумножитель очень ярким светом от поверхности покровного стекла.

Интерференционные отражательные цифровые снимки, полученные по методике конфокальной отражательной микроскопии, представлены на рисунке 2. На рисунке 2 (a) изображен оптический срез фибробласта сердца цыпленка, снятый на поверхности раздела клетка-субстрат. Темные прожилки на периферии клетки не что иное, как фокальные контакты. X-z сечение такой же клетки изображено на рисунке 2 (b). Покровное стекло на рисунке 2 (b) чрезвычайно яркое. При фокусировке микроскопа, оно проявляется как вспышка (красная стрелка), а область адгезии клетки с субстратом наблюдается прямо за этой вспышкой.

Недавно, с помощью соответствующей методики, были получены улучшенные изображения филоподий клеток PC12 (феохромоцитома крысы), их выращиванием на субстрате с более высокой отражательной способностью. Эта методика, названная конфокальной микроскопией в отраженном свете, усиленном обратным рассеянием, дает изображения, похожие на те, которые получают с помощью дифференциального интерференционного контраста (ДИК). С ее помощью можно получать изображения неокрашенных клеток, растущих на непрозрачном субстратах, таких как кремниевые кристаллы, что невозможно создать традиционным методом ДИК в проходящем свете.

Одним из преимуществ наблюдения живых клеток в отраженном свете, по сравнению с флуоресценцией, является отсутствие артефактов фотообесцвечивания. Тем не менее, угроза повреждения живых образцов при облучении светом все же существует, поэтому необходимо соблюдать все меры предосторожности, чтобы этого избежать. Конфокальная отражательная микроскопия была успешно применена для наблюдения миграции клеток через коллагеновую матрицу и образования фибрилл in vitro. Это было сделано в ходе съемки в заданный временной интервал z-серий с последующей трехмерной реконструкцией (так называемая 4-D визуализация). Такие наблюдения стали возможными благодаря высокой отражательной способности, или альбедо, коллагеновых полимеров.

Недостатком конфокальной отражательной микроскопии (по сравнению с конфокальной флуоресцентной) является отсутствие специальных красителей-меток, по-разному отражающих свет и необходимых для проведения экспериментов со многими метками. И эту ситуацию трудно исправить, особенно если учесть множество зондов с различной длиной волны, доступных в иммунофлуоресценции и визуализации живых клеток. В качестве зондов при наблюдениях в отраженном свете с одной меткой используются золотые частицы, пероксидаза и микрокристаллы галогенидов серебра.

Рис. 3. Микрокристаллы галогенидов серебра в конфокальной отражательной микроскопии

В качестве примера существенного улучшения изображения, полученного в конфокальной отражательной микроскопии, по сравнению с традиционной светлопольной и темнопольной микроскопией, можно привести визуализацию микрокристаллов галогенидов серебра в авторадиограмме образцов, приготовленных для гибридизации in-situ (рисунок 3). Внефокусное свечение микрокристаллов галогенидов серебра во всей эмульсии эффекти вно исключается из фокусного изображения этих микрокристаллов, связанных с рибозондом, благодаря использованию метода оптических срезов при исследовании эмульсии с помощью конфокальной отражательной микроскопии.

На рисунке 3 представлены несколько снимков, полученных при наблюдении микрокристаллов галогенидов серебра с помощью конфокальной отражательной микроскопии. Образцом являются клетки периферической крови ВИЧ-инфицированного человека, приготовленные для гибридизации in-situ и окрашенные красителем Гимза. На рисунке 3 (a) представлено изображение, полученное при стандартном светлопольном освещении; то же самое поле, с большим количеством внефокусного «мусора», изображено на рисунке 3 (b) при темнопольном освещении. Изображение того же поля, полученное с помощью конфокальной отражательной микроскопии, представлено на рисунке 3(с). Примечательно, что на нем уже нет того внефокусного «мусора». В дополнение к результатам, полученным при светлопольном и темнопольном методах, можно еще получить снимок методом дифференциального интерференционного контраста, для сравнения его с рисунком 3 (с).

Поскольку конфокальное изображение в отраженном свете и изображения в проходящем свете (светлопольное и темнопольное) получены одновременно, одним сканирующим лучом (рисунок 3), они соотносятся между собой и могут быть слиты в одно изображение с помощью цифровой обработки. Светлопольное изображение в проходящем свете показывает всю популяцию клеток целиком, как в оттенках серого, так в реальном цвете (при условии, что микроскоп имеет приемник проходящего света в реальном цвете). Изображение, полученное при темнопольном освещении, содержит информацию о распределении популяции микрокристаллов галогенидов серебра во всей эмульсии, включая все засоряющие изображение частички пыли на стеклянных поверхностях. Конфокальное отражательное изображение, напротив, отображает только окрашенные клетки (рисунок 3 (с)), поэтому по сравнению с изображениями в проходящем свете, оно точнее отражает распределение меченых клеток. Более того, оно удобнее для количественного анализа зонда, поскольку состоит из отдельных участков пикселей интенсивного цвета (сигнал от зонда) на черном фоне, и в этом смысле, напоминает флуоресцентное изображение.

Рис. 4. Объединённые изображения микрокристаллов галогенидов серебра

Изображения, полученные методом конфокальной отражательной микроскопии, объединяются цифровым способом с изображениями, полученными в проходящем свете, в целях большей информативности и подсчета меченых клеток во всей клеточной популяции. В большинстве конфокальных систем, изображение, полученное в проходящем свете, заносится в один из каналов RGB изображения (обычно синий), а изображение в отраженном свете, или одно или несколько флуоресцентных изображений, полученных одновременно с первым, заносятся в красный и зеленый каналы. Изображение в проходящем свете, представленное таким образом, имеет цветной фон, как показано на рисунке 4 (a), вместо более знакомых градиентов серых тонов типичного светлопольного или ДИК изображения, или вместо черного фона темнопольного изображения. Более реалистичный вариант изображения в проходящем свете получается с помощью программы обработки изображений Adobe PhotoShop (как показано на рисунке 4 (b)), когда оно вставляется в разный с изображением в отраженном свете слой.

Конфокальная отражательная микроскопия обычно применяется в дополнение к флуоресцентной, для добавления контекста флуоресцентным изображениям, которые могут выглядеть довольно абстрактно, если рассматривать их отдельно (особенно конфокальные флуоресцентные изображения, иногда состоящие из нескольких белых пикселей в море черного фона). В примерах, приведенных выше, комбинация специального иммунофлуоресцентного окрашивания и техники оптических срезов конфокальной микроскопии, в действительности, может затруднить интерпретацию самих изображений, если они не будут объединены методами цифровой обработки с изображениями в отраженном и проходящем свете и с контрастно-окрашенными изображениями.

Хотя приложения конфокальной отражательной микроскопии в биомедицине ограничены, иногда она помогает получить дополнительную информацию об образцах, отражающих свет или имеющих существенные колебания показателей преломления на границах определенных сред. Эту полезную методику, наряду с визуализацией в проходящем свете, иногда стоит применить при наблюдении флуоресцентно-окрашенных образцов с помощью конфокального микроскопа.