Основные понятия и уравнения микроскопии

Чтобы в полной мере использовать возможности оптического микроскопа, необходимо глубокое понимание фундаментальных физических принципов, лежащих в основе его работы. Такие важные в микроскопии понятия, как разрешающая способность, числовая апертура, глубина поля, яркость изображения, рабочее расстояние объектива, сопряжённые плоскости и диапазон полезного увеличения, обсуждаются в статьях, ссылки на которые приведены ниже.

Сопряжённые плоскости в оптическом микроскопе. Анализ оптической системы правильно сфокусированного и отъюстированного оптического микроскопа выявляет наличие в ней двух наборов сопряжённых друг с другом фокальных плоскостей вдоль оптического пути микроскопа. Один набор состоит из четырёх полевых плоскостей и называется набором сопряжённых плоскостей изображения или сопряжённых полевых плоскостей, в то время как другой набор, называемый набором сопряжённых плоскостей освещения, состоит из апертурных плоскостей. Все плоскости в каждом наборе сопряжены между собой, поскольку одновременно находятся в фокусе, и при наблюдении образцов в микроскоп накладываются друг на друга.

На рисунке 1 представлена схема современного микроскопа (Nikon Eclipse E600) в разрезе, на которой показано принципиальное расположение оптических компонентов, составляющих два набора сопряжённых плоскостей, находящихся в оптическом пути микроскопа, при наблюдении как в проходящем, так и падающем (отражённом или эпископическом) свете. Компоненты набора сопряжённых полевых плоскостей обозначены чёрным шрифтом, а плоскости апертурного набора (т.е. набора освещения) – красным шрифтом. Следует обратить внимание, что обозначенные сопряжённые плоскости относятся как к режиму непосредственно наблюдения, так и к режиму формирования изображения (микрофотографированию). В таблице 1 приведён список элементов, составляющих каждый набор сопряжённых плоскостей, в том числе их часто используемые альтернативные обозначения (заключённые в скобках), которые могут встретиться в литературе. Существует небольшая разница в относительном положении полевой и конденсорной диафрагмы в зависимости от применяемого освещения (падающего или проходящего), что будет пояснено позже.

Сопряжённые фокальные плоскости

Таблица 1

В режиме обычного наблюдения (с помощью окуляров) сопряжённый набор предметных или полевых плоскостей может наблюдаться одновременно, при условии, что образец находится в фокусе. Этот режим наблюдения называется ортоскопическим, а получаемое при этом изображение – ортоскопическим изображением. Для наблюдения сопряжённого набора апертурных или дифракционных плоскостей требуется приведение задней апертуры объектива в фокус, для чего необходимо, чтобы микроскоп был оснащён телескопическим окулярным тубусом (вместо окуляра) или встроенной линзой Бертрана. Этот режим наблюдения называется коноскопическим, апертурным или дифракционным, а изображение, наблюдаемое в задней апертуре объектива, соответственно, – коноскопическим изображением. Хотя обозначения «ортоскопический» и «коноскопический» довольно часто встречаются в литературе, многие микроскописты предпочитают называть эти режимы нормальным и апертурным, соответственно, поскольку эта терминология ближе к работе микроскопа, как таковой. Плоскости, принадлежащие к разным сопряжённым наборам, чередуются между собой по ходу луча, начиная от нити источника света и заканчивая изображением, формируемым на сетчатке или плоскости изображения фотоприёмника. Глубокое понимание соотношений между этими наборами сопряжённых плоскостей и их расположением в микроскопе существенно для правильного представления о формировании изображения и правильной настройки освещения. К тому же, расположение главных сопряжённых плоскостей часто является ключевым фактором при монтаже таких оптических компонентов, как фазовые пластины, призмы Волластона в методе дифференциального интерференционного контраста (ДИК), поляризаторов, модуляторов, фильтров и окулярных сеток.

На рисунке 2 представлен ход луча освещения и луча, формирующего изображение, в микроскопе, настроенном для освещения по Кёлеру. Плоскости каждого сопряжённого набора по ходу лучей снабжены стоящими посредине надписями. На рисунке отчётливо виден взаимно обратный характер двух этих наборов сопряжённых плоскостей микроскопа. Оптически, соотношение между сопряжёнными плоскостями этих наборов основывается на том факте, что сферический волновой фронт освещающего пучка (показан красным) сводится в фокус в апертурных плоскостях, а сферический волновой фронт пучка изображения (показан жёлтым) – в полевых плоскостях. Световой пучок, сфокусированный в сопряжённых плоскостях одного набора, оказывается почти параллельным при прохождении через сопряжённые плоскости другого набора. Взаимно обратное соотношение между сопряжёнными плоскостями этих двух наборов определяет суть взаимодействия двух пучков на оптическом пути при формировании изображения в микроскопе, а также имеет практическое значение для работы микроскопа.

Освещение является, возможно, наиболее важным фактором, определяющим общую производительность оптического микроскопа. Заполнение освещением всей апертуры и поля измерительного прибора лучше всего достигается при настройке его осветительной системы в соответствии с принципами, впервые введёнными Августом Кёлером в конце девятнадцатого века. Именно в условиях освещения по Кёлеру удовлетворяются требования по расположению сопряжённых фокальных плоскостей двух разных наборов (полевых и апертурных плоскостей) в физически строго определённых в микроскопе местах. Настройка каждого отдельного микроскопа для освещения по Кёлеру в некоторой степени может зависеть от того, насколько требования для этого освещения учитывались при его производстве, но здесь эти подробности не обсуждаются.

Основные требования освещения по Кёлеру очень просты. Собирающая линза блока осветителя должна сводить лучи, испускаемые из разных точек нити накаливания лампы в переднюю апертуру конденсора, заполняя её при этом полностью. В то же время, конденсор должен быть сфокусирован таким образом, чтобы сопряжённые плоскости из двух наборов были выставлены в определенное положение по оптической оси микроскопа (при условии, что образец находится в фокусе). Выполнение этих условий обеспечивает яркое и ровное освещение плоскости образца даже такими, по своему существу, неоднородными источниками света, как галогенная лампа с вольфрамовой нитью (поскольку сама нить не фокусируется в плоскости образца). Нахождение образца и конденсора в фокусе обеспечивает правильное положение сопряжённых фокальных плоскостей; при этом разрешающая способность и контрастность доводятся регулировкой полевой диафрагмы и апертурной диафрагмы конденсора.

Расположение апертурных сопряжённых плоскостей

Понятие сопряжённости отдельных плоскостей на оптическом пути микроскопа означает их эквивалентность. То есть, то, что появляется в фокусе одной из плоскостей сопряжённого набора, обязательно будет в фокусе и всех других плоскостей, принадлежащих этому же набору. С другой стороны, взаимно обратный характер двух наборов сопряжённых плоскостей микроскопа требует, чтобы объект, сфокусированный в одном наборе плоскостей, был вне фокуса в другом наборе. Существование двух взаимосвязанных оптических путей и двух наборов плоскостей характерно для освещения по Кёлеру и лежит в основе использования различных регулируемых апертурных диафрагм микроскопа для регулировки угла конуса света, размера светового пятна, яркости и равномерности освещения в поле зрения. Плоскости, принадлежащие к полевому набору, иногда называются плоскостями, ограничивающими поле, поскольку любая диафрагма, помещённая в одну из этих плоскостей, ограничивает диаметр изображения поля. Плоскости, софокусные и совмещённые с изображением образца, представлены на рисунке 3. Апертурные плоскости могут считаться ограничивающими апертуру, поскольку числовая апертура оптической системы может регулироваться установкой в одну из этих плоскостей постоянной или переменной (ирисовой) диафрагмы. Взятые вне микроскопа компоненты оптической системы, представляющие набор апертурных плоскостей, т.е. не являющихся софокусными с образцом, показаны на рисунке 4.

Микроскопист может не знать, что в нормальном режиме наблюдения, изображение образца, в действительности, является комбинированной проекцией четырёх плоскостей сфокусированного изображения (включая плоскость самого образца), оптические характеристики которого определяются или модулируются другим набором четырёх (несущих расфокусированное изображение) апертурных плоскостей. Если микроскоп хорошо отъюстирован, об этом можно не задумываться. Однако когда необходимо исправить серьёзные дефекты изображения, механизм его формирования становится более понятным и приобретает непосредственный практический интерес. Понимание расположения и вклада в формирование изображения каждой из сопряжённых полевых и апертурных плоскостей является необходимым при устранении возникающих в процессе наблюдения проблем. Это также необходимо для правильной установки и использования фильтров, диафрагм, фазовых колец, ДИК призм и других оптических компонентов. В конструкции современных микроскопов учитывается расположение сопряжённых плоскостей и необходимость их доступности для микроскописта.

Скачать полную версию статьи в формате pdf