Цифровое формирование изображений – возможности микроскопии (I)

Сегодня весь рынок систем формирования изображений охвачен взрывным развитием цифровых технологий. Новейшие цифровые камеры, вкупе с мощными компьютерными программами, обеспечивают качество изображений, сравнимое с качеством традиционной галогенидосеребряной пленочной фотографии. Кроме того, цифровые камеры более просты в использовании и предоставляют более широкие возможности для обработки и хранения изображений.

Рис. 1. Флуоресцентное цифровое изображение среза кишечника мыши

Цифровые технологии все шире применяются для формирования изображений в микроскопии, где требуется высокое разрешение, точность цветопередачи и аккуратное обращение с освещением, на которое, зачастую, накладываются весьма жесткие ограничения. Предъявляемые требования кажутся трудновыполнимыми даже для традиционной пленочной фотографии, зачем же пытаться использовать в таких условиях цифровые технологии формирования изображений? Настоящая публикация как раз и посвящена тому, как осуществляется цифровое формирование изображений в упомянутых условиях, и какие преимущества эта технология дает оптической микроскопии.

На рисунке 1 представлено цифровое изображение толстого среза кишечника мыши, окрашенного тремя флуорофорами. Снимок получен цифровой фотокамерой Nikon DXM1200 через стереомикроскоп SMZ1500. Снимок был сделан с использованием комбинации флуоресцентного освещения и фирменного метода компании Nikon — наклонного когерентного контраста (OCC). Представленный на рисунке окончательный вариант был получен путем интеграции четырех композиций в программе Photoshop.

Почему речь идет о цифровом формировании изображений?

Важно отметить, что качество окончательного снимка, — цифрового или пленочного, зависит от качества исходного изображения, обеспечиваемого микроскопом. Как бы ни была хороша цифровая или пленочная фотокамера, она не сможет дать снимки хорошего качества через плохо настроенный микроскоп. Более того, и пленочные, и цифровые камеры могут выявить недостатки, которые не видны непосредственно при наблюдении через окуляры микроскопа.

С общим развитием электронных систем связи возникает реальная потребность в цифровых изображениях, которые можно легко пересылать большому количеству пользователей. Например, цифровые изображения можно пересылать по электронной почте для консультации и обсуждения, вставлять в другие цифровые документы, пересылать в специальные системы анализа, либо размещать на веб-сайтах, откуда их можно легко копировать, сохранять и архивировать. При помощи соответствующего программного обеспечения цифровые изображения легко можно снабжать комментариями и включать в презентации или архивы. Если для получения цифрового изображения из фотографического, последнее необходимо сканировать и загрузить в компьютер, то регистрация и получение изначально цифрового изображения экономит время и силы.

Большинство цифровых фотокамер работают по принципу «навел и щелкнул», не требуя практически никакого фотографического опыта. И, напротив, традиционная микрофотография требует знания определенных методов фотографирования. Пользователь должен разбираться в преимуществах и недостатках пленок различных типов, тщательно выбирать фильтры и иметь некоторое представление о взаимосвязях между апертурами объектива, скоростями затвора, глубиной резкости и, в случае цветной микрофотографии, цветовой температурой. При этом результаты могут быть разными, особенно, у новичков, вследствие чего важным аспектом становится практика «пристрелки» экспозиции для критичных снимков, т. e., получение, как минимум, трех отдельных снимков, чтобы хотя бы один из них был удачным. Однако, это повышает расходы на пленку и обработку. Цифровая съемка свободна от таких расходов.

Цифровая фотография практически моментальна. Большинство камер оснащено ЖК-дисплеями для просмотра изображений, а также интерфейсом для пересылки в ЗУ компьютера. Качество снимка можно оценить практически мгновенно. И, напротив, чтобы просмотреть пленку, ее необходимо сначала проявить и обработать. За это время объект съемки может попросту исчезнуть, особенно, в случае регистрации динамических процессов в живых клетках.

Некоторые характеристики цифровых камер

Камеры могут оснащаться цифровым или аналоговым выходом. Для аналогового выходного сигнала существует несколько различных стандартов, например, PAL, NTSC или RS-170. Пересылка данных также осуществляется в нескольких форматах, например, RGB, S-VHS или в виде полного (составного) сигнала. Прежде чем аналоговый сигнал можно будет переслать в ЗУ компьютера, его необходимо преобразовать в цифровую форму при помощи устройства ввода кадров, тогда как цифровая камера выдает сигнал, готовый для пересылки непосредственно в компьютер. Это уменьшает количество помех и делает ненужным устройство ввода кадров. Цифровые сигналы можно пересылать в компьютер по последовательному или параллельному интерфейсам (медленно), по шине USB (быстрее, имеется практически во всех современных компьютерах), по каналу Fire Wire (быстрее, чем USB, но не столь широко распространен), либо через платы, установленные на шине PCI (максимально быстро, широко используется, но требует установки в компьютер дополнительной платы).

Рис. 2. Элементы окна программы ACT-1 для управления микроскопом DXM 1200 Digital Eclipse

Цифровые системы формирования изображений отличаются по скорости передачи данных в компьютер, — немаловажный аспект для тех, кто делает большое количество снимков. Для пользователя, работающего с небольшими объемами информации, минута ожидания загрузки изображения в ПК может быть вполне приемлемым временем, но для лаборатории с интенсивной загрузкой это может стать серьезным ограничением производительности.

На рисунке 2 представлен Windows-интерфейс для цифровой камеры Nikon DXM1200. Эта камера подключается к компьютеру через фирменную плату, устанавливаемую в материнскую плату компьютера. Ввод/вывод осуществляется специальной сопровождающей программой Automatic Camera Tamer (ACT).

Для фокусировки и позиционирования важен поток текущих «живых» изображений (в режиме реального времени), по этой причине камера должны быть оборудована встроенным контрольным ЖК-монитором, либо средствами вывода текущих изображений на дисплей ПК. ЖК-монитор камеры должен быть достаточно большим, чтобы обеспечивать должное качество изображения, особенно, в отсутствие функции передачи текущих изображений на дисплей ПК. ЖК-дисплеи некоторых камер можно поворачивать в направлении пользователя, что облегчает просмотр. Это может оказаться важным, особенно, для микроскопистов.

Тем пользователям, которым приходится использовать свои камеры для различных задач, следует отдать предпочтение камерам, которые легко устанавливаются на микроскоп, и так же легко с него снимаются. Возможно, самым важным критерием выбора камеры является ее разрешающая способность. Камера должна регистрировать тончайшие детали, выявляемые микроскопом во всем диапазоне увеличений. Цифровое изображение состоит из миллионов крохотных квадратиков, называемых элементами изображения, или пикселями. Пиксели используются для отображения или печати изображений, — чем больше пикселей приходится на единицу площади, тем выше разрешение (четкость) изображения. При увеличении изображения наступает момент, когда его элементы становятся видны в виде отдельных точек, — явление, аналогичное зернистости галогенидосеребряных фотографий. Чем большее количество пикселей содержит изображение, тем больше его можно увеличить, прежде чем станут различаться отдельные пиксели. Размер изображения может описываться его размерностью, например, 1500×1700 пикселей, либо полным числом пикселей, — в нашем случае это 2,55 миллиона. Часто разрешение определяется, как размер прибора с зарядовой связью (ПЗС), что, по сути, есть количество пикселей на кристалле. Однако, следует отметить, что у ПЗС разных типов размеры отдельных пикселей различны. Для микроскопии следует считать идеальным пиксель (квадратный) со стороной 6,7 мкм.

Попав в камеру, свет проходит через светофильтр, который делит пиксели на красные, зеленые и синие, — соответственно цветам, использующимся для формирования полноцветного изображения. Затем световые лучи направляются на ПЗС — специальный полупроводниковый прибор, преобразующий световое излучение в электрические заряды. Величина каждого из этих электрических зарядов пропорциональна интенсивности светового потока, пришедшего от объекта. Величины, хранящиеся в цифровом изображении, определяют яркость и цвет каждого пикселя.

Высокое разрешение

В некоторых камерах номинальное разрешение достигается за счет дополнительной экстраполяционной программной операции, которая «вычисляет» значение между двумя пикселями. Это значение используется в окончательном «экстраполированном» изображении. В других камерах формируются три отдельных изображения, — по одному для каждого цвета: красного, зеленого и синего. Затем эти изображения объединяются в изображение с полным разрешением (неэкстраполированное). Недостаток этого метода заключается в утроении времени экспонирования.

Рис. 3. Микроскоп Nikon Eclipse E800 с цифровой камерой и главным компьютером

Кроме того, добиться высокого разрешения можно с помощью новой технологии, недавно реализованной компанией Nikon в ее цифровой камере DXM1200 (рисунки 2 и 3). Эта технология, известная под названием межпиксельного пошагового приближения (Inter Pixel Stepping, IPS), использует пьезоэлектрический механизм для увеличения разрешающей способности матрицы, примерно, на 1/3 пикселя, путем ее перемещения вперед или назад, например, на девять ступеней (в сумме). В нашем случае разрешающая способность и размер изображения увеличиваются в 9 раз. При использовании этого метода несколько изображений усредняются и формируют более четкое изображение с меньшим количеством искажений. Камера DXM1200 формирует высококачественное изображение, состоящее, приблизительно, из 12 миллионов пикселей. Это практически эквивалентно количеству галогенидосеребряных зерен на традиционной 35 миллиметровой пленке. Таким образом, по качеству цифровые изображения, полученные при помощи этой камеры, конкурируют с изображениями, полученными с использованием традиционной фотопленки, а по возможностям увеличения даже превосходят их. Малошумящая конструкция камеры DXM1200 особенно подходит для съемки в условиях низкой освещенности, например, при исследовании флуоресцирующих образцов. Три уровня чувствительности и длинные выдержки (до 170 секунд) позволяют снимать тусклые образцы.

Программное обеспечение

Несомненно, программное обеспечение является важным компонентом цифровой камеры. Более мощное программное обеспечение предоставляет пользователю больше функциональных возможностей, однако должно соответствовать потребностям лаборатории. С камерой DXM1200 поставляется программный пакет ACT-1 для получения изображений, адресованный профессиональным пользователям и обладающий уникальными функциональными возможностями и простой в использовании.

Основы формирование цифровых изображений

Основным носителем информации в сфере микрофотографии в течение последних пятидесяти лет была фотопленка, исправно воспроизводившая бесчисленные изображения, сформированные оптическими микроскопами. И только в последнее десятилетие усовершенствования в сфере электронных камер и компьютерных технологий сделали цифровую фотосъемку дешевле и проще традиционной фотографии.

Рис. 4. Оптический микроскоп с цифровой камерой

На рисунке 4 представлен микроскоп Nikon Eclipse 600 проходящего/отраженного света, оснащенный цифровой фотокамерой с термоэлектрическим охлаждением (на элементе Пелтье), способной интегрировать изображения в течение длительного периода сбора данных. Камера управляется отдельным устройством, подключенным к порту FireWire IBM-совместимого персонального компьютера. Периоды интегрирования и другие параметры сбора изображений задаются при помощи специальной программ, работающей в среде Windows.

Фотокамера с формирователем изображения на приборе с зарядовой связью (ПЗС-камера), оснащенная аналого-цифровым преобразователем (АЦП), обычно называется цифровой камерой. Поскольку ПЗС-кристаллы, как и все оптические датчики, являются аналоговыми устройствами и формируют переменные напряжения, термин «цифровая камера» используется только в том случае, когда эти напряжения преобразуются в цифровую форму в самóй камере и выводятся в совместимом с компьютером формате. В 12-разрядной цифровой камере аналоговый сигнал от ПЗС преобразуется встроенным АЦП в 12-битовую кодовую последовательность. Будет ли выходной сигнал в действительности разрешен на 4096 дискретных уровней интенсивности (12 разрядов) зависит от собственных шумов камеры. Чтобы иметь возможность различать отдельные уровни интенсивности, каждый из ступенчатых уровней яркости (градаций серого) должен в 2,7 раза превышать уровень шумов камеры. В противном случае, различие между ступенями, например, 2982 и 2983 будет невозможно определить с какой-либо степенью достоверности. Уровни собственных шумов некоторых 12-разрядных камер настолько велики, что не позволяют различить 4096 дискретных значений.

Если сигнал изначально аналоговый, зачем преобразовывать его в цифровой вид в камере, а не где-нибудь дальше? Встроенный в камеру АЦП дает два преимущества: снижение уровня помех и совместимый с компьютером выход. В общем случае, чем ближе АЦП к фотоприемнику, тем ниже уровень шумов. Низкоуровневые аналоговые сигналы от ПЗС намного сильнее искажаются помехами, чем их высокоуровневые цифровые эквиваленты. В идеальном случае, АЦП должен находиться на кристалле матрицы ПЗС, непосредственно возле выхода усилителя фотоприемника. Чем ниже уровень шумов, тем большее количество уровней яркости можно идентифицировать и, следовательно, тем большее количество значащих разрядов можно использовать для измерения интенсивности.

Рис. 5. Архитектура приборов с зарядовой связью

В сравнении с аналоговыми вариантами цифровые камеры обладают рядом преимуществ. В отличие от видеокамер, в которых используется чересстрочная развертка, цифровые камеры работают по принципу построчной развертки. Для оцифровывания чересстрочных видеосигналов требуются специальные платы захвата изображений и буферы кадров. Выходной сигнал камеры с построчной разверткой можно подавать непосредственно в компьютер (например, по интерфейсам IEEE-1394, RS-422 или SCSI). В камере с механизмом построчного сканирования изображение сначала полностью формируется за время экспонирования (называемого также, периодом интегрирования) а затем построчно считывается сверху вниз. Современные быстродействующие усилители и АЦП позволяют получать на выходе цифровой камеры полнокадровые изображения со скоростями, равными или превышающими скорость передачи кадров видеокамерами.

Еще одно преимущество цифровых камер состоит в том, что их выходной сигнал полностью соответствует формату сигнала для компьютерного монитора. Цифровой сигнал существенно упрощает хранение, обработку и отображение изображений, в сравнении с аналогичными операциями над видеосигналами. Цифровая фотография устраняет трудности, связанные с позитивами, слайдами и негативами, поскольку многие научные журналы сегодня принимают файлы цифровых изображений. Результат — улучшение качества изображений в публикациях и на презентациях. Цифровое изображение можно обрабатывать, сжимать, передавать через Интернет, вставлять в документы или преобразовать в постер.

Архитектура матриц ПЗС

В цифровых камерах, как правило, используются матрицы ПЗС двух типов: с построчным и с покадровым переносом. Рядом с каждым фотодиодом матрицы с построчным переносом имеются каналы переноса заряда, благодаря чему накопленный заряд эффективно и быстро сдвигается по этим каналам (рисунок 5). Фотоприемники построчного переноса можно электронным способом «заслонять», сбросив хранящийся заряд вместо того, чтобы сдвинуть его в каналы переноса. Фотоприемник матрицы ПЗС с покадровым переносом состоит из двух частей, верхняя из которых закрыта светонепроницаемой маской и используется в качестве области хранения. Свет пропускается на открытую часть матрицы, после чего накопленный заряд быстро сдвигается в закрытую область хранения. Пока сигнал интегрируется светочувствительной областью фотоприемника, происходит считывание сохраненного заряда.

В научных приложениях используются цветные цифровые камеры двух типов: с одиночной матрицей ПЗС и частотно-селективным фильтром, либо камеры с трехэлементными матрицами ПЗС. Для формирования красного, зеленого и синего полей зрения в камерах обоих типов используются фильтры. В камерах с одним фотоприемником, для последовательного формирования красного, зеленого и синего изображений, используется диск со светофильтрами или жидкокристаллический перестраиваемый фильтр. В камере с трехэлементным фотоприемником используется призма-светоделитель и распределяющие фильтры, что позволяет каждому фотоэлементу воспринимать только «свой» цвет и, в итоге, формировать одновременно три изображения. Из-за наличия дополнительных светоделителей и частотно-селективных компонентов цветные камеры всегда менее чувствительны, чем их монохромные аналоги. В некоторых областях, особенно, в иммунофлюоресценции, потеря чувствительности компенсируется возможностью формировать изображения в нескольких спектральных диапазонах одновременно, или в очень высокоскоростной последовательности. Кроме того, разрешающая способность некоторых камер повышается за счет диагонального смещения каждого красного, зеленого и синего фотодиодов на одну треть пикселя, в результате чего получаются утроенные выборки.

Хотя, производители и пользователи ПЗС-камер, как правило, рассматривают каждый фотодиод, как пиксель (элемент изображения), между количеством и положениями фотодиодов матрицы и пикселей на мониторе компьютера или на принтере нет обязательного соответствия. Тем не менее, разрешающая способность дисплея или принтера должна быть, как минимум, не хуже разрешающей способности фотоприемника.

Квантовый выход

Квантовым выходом (QE) называется процентное количество зарегистрированных падающих фотонов. (Для справки: QE дневного (фотопического) зрения человека составляет, примерно, 3%; см. рисунок 6). Квантовый выход кремниевых фотодиодов — основных структурных элементов матриц ПЗС, составляет 80% в пределах всей видимой и ближней ИК области спектра (см. рисунок 6). Спектральная чувствительность матрицы ПЗС ниже аналогичного параметра отдельного кремниевого фотодиода, поскольку на поверхности матрицы имеются каналы переноса заряда, снижающие пиковый квантовый выход, примерно, до 40%.

Рис. 6. Спектральная чувствительность различных ПЗС

Недавно удалось повысить прозрачность каналов считывания некоторых матриц ПЗС научно-исследовательского класса и довести квантовый выход в сине-красном диапазоне до 70%. Потери чувствительности из-за поверхностных каналов полностью отсутствуют в ПЗС-фотоприемниках. В этом случае свет падает на специально вытравленную до прозрачности область на подложке матрицы ПЗС. Это позволяет достичь квантового выхода в 90%. Однако, утончение обратной стороны фотоприемника делает его хрупким и достаточно дорогим, что позволяет сегодня использовать такие фотоприемники в ПЗС-камерах только научно-исследовательского класса с медленной разверткой.

Шумы в ПЗС-камерах

ПЗС-камерам свойственны два основных вида шумов — шум темнового тока и шум считывания. Хотя за последние годы были достигнуты значительные успехи в снижении шума темнового тока матриц ПЗС при комнатной температуре, охлаждение кристалла на каждые 20°C дает дополнительное десятикратное снижение этого шума. Лучше всего темновой шум проявляется в виде «горячих» пикселей (белых точек) на изображениях, формируемых ПЗС-камерами при комнатной температуре после 4–5 секундного периода интегрирования. Охлаждения до 0°C, обычно, достаточно для увеличения периода интегрирования до 30 секунд. Для экспериментов, требующих больших времен экспонирования (например, хемилюминесценции), требуется охлаждать фотоприемник до еще более низких температур. Цифровые камеры выпускаются в охлаждаемых и неохлаждаемых вариантах.

Рис. 7. Источники шумов в матрицах ПЗС

Шумы в цифровых камерах могут порождаться различными источниками. На рисунке 7 представлены осциллограммы некоторых наиболее распространенных шумов. Фотонный шум, темновой ток, шум с постоянным спектром и неравномерность распределения светочувствительности генерируются или обусловлены собственно матрицей ПЗС, а шум сброса, «белый» шум и шум квантования генерируются в процессе усиления и преобразования аналогового сигнала в цифровую форму. Шум считывания генерируется расположенным на кристалле ПЗС усилителем преобразования заряда, хранящегося в каждом фотодиоде (т. е., пикселе) в аналоговое напряжение, которое, затем, поступает на АЦП. Шум считывания можно рассматривать, как неизбежную «плату» за считывание хранящегося заряда. Благодаря совершенствованию конструкций матриц ПЗС, а также методов синхронизации и выборки, за последние несколько лет эта величина неуклонно снижается до 5–10 электронов/пиксель. Шум считывания пропорционален скорости считывания. Плата за скорость — рост уровня шума и, как следствие, увеличение неопределенности при измерении напряжения и меньшее количество разрядов разрешения. Именно поэтому у камер с медленной разверткой, в общем случае, уровень шума считывания меньше, а количество значащих разрядов больше, чем у быстродействующих фотоприемников. Диапазон разрядности выходного сигнала цифровых камер простирается от 8–12 разрядов при скорости 30 кадров в секунду до 16 разрядов при скорости 1–2 кадра в секунду.

Одно из решений проблемы скорости/шума считывания состоит в использовании на больших матрицах ПЗС нескольких выходных усилителей (отводов). Вместо считывания сохраненного заряда со всей матрицы ПЗС через один усилитель, матрица разделяется на четыре или на восемь секций, в каждой из которых имеется собственный усилитель. Изображение считывается по частям, а затем программно «сшивается» со скоростью нескольких кадров в секунду. Соответственно, снижается необходимая скорость и шум считывания, связанный с каждым усилителем.

Поскольку фотоны попадают на поверхность фотоприемника неупорядоченно, их количество изменяется и порождает шум, описываемый статистикой Пуассона, и равный корню квадратному из числа зарегистрированных фотонов. Естественно, к этому флуктуационному шуму добавляется шум камеры, что дополнительно снижает отношение сигнал/шум (С/Ш). Наибольшее возможное для цифровой камеры отношение С/Ш равно корню квадратному из максимального накопленного заряда (полной емкости). Простой метод оценки отношения С/Ш для любой однородной области изображения состоит в делении усредненной интенсивности рассматриваемой области на среднеквадратичное отклонение интенсивности этой же области.

Необходимое количество элементов изображения в цифровой камере

Разрешающая способность матрицы ПЗС является функцией количества имеющихся в ней фотодиодов и их размера относительно проецируемого изображения. Сегодня обычными для цифровых камер стали матрицы ПЗС, состоящие из 1000×1000 фотодиодов. Тенденция в производстве бытовых и профессиональных ПЗС-камер состоит в уменьшении размеров фотоэлементов, — в некоторых матрицах ПЗС фотодиоды имеют размеры 4×4 микрона. Согласно теории дискретизации, для достижения адекватного разрешения объекта необходимы, минимум, две выборки для каждой разрешимой единицы. (Для обеспечения должного уровня дискретизации многие пользователи предпочитают делать три выборки на разрешимую единицу).

Табл. 1. Требования к размерам пикселей для обеспечения максимального разрешения в оптической микроскопии

При длине волны 550 нанометров, в эпифлуоресцентном микроскопе дифракционный предел Аббе для объектива с числовой апертурой 1,4 составляет 0,22 мкм. Для объектива со 100-кратным увеличением проецируемый размер дифракционно-ограниченного пятна на поверхности матрицы ПЗС составит 22 мкм. Таким образом, фотодиод с размерами 11×11 мкм обеспечивает минимально необходимое оптическое и электронное разрешение, а предпочтительным является фотодиод с размерами 7×7 мкм. В таблице 1 представлены требования, предъявляемые к размерам пикселей, с целью достижения максимального разрешения для объективов с коэффициентами увеличения от 4x до 100x. Для объектива 100x без дополнительного увеличения, матрица ПЗС с одним миллионом (1000×1000) фотодиодов размерами 7×7 мкм каждый охватывает в плоскости объекта поле зрения размером 70×70 мкм. Когда размер изображения, проецируемого на матрицу ПЗС, должным образом согласован с соответствующим уровнем дискретизации, увеличение числа фотодиодов в матрице ПЗС увеличивает поле зрения, но не разрешающую способность. С тем, чтобы конечный продукт при окончательном увеличении имел надлежащее разрешение, параметры разрешающей способности различных выходных устройств могут потребовать избыточной дискретизации на фотоприемнике.

Динамический диапазон

Внутрикадровым динамическим диапазоном называется эффективный диапазон интенсивностей, которые можно одновременно различить в одном поле зрения. Межкадровый динамический диапазон представляет собой возможный диапазон интенсивностей, когда коэффициент усиления фотоприемника, время интегрирования, апертура объектива и другие параметры настроены на различающиеся поля зрения. Хотя, с точки зрения разрешающей способности, предпочтительны фотодиоды малых размеров, они ограничивают динамический диапазон устройства. Полная емкость матрицы ПЗС, примерно, в 1000 раз превышает площадь поперечного сечения каждого из фотодиодов. Таким образом, полная емкость матрицы ПЗС с пикселями 7×7 мкм должна составлять 49000 электронов или дырок. (Дыркой называется область кремния, из которой удален электрон, и которая является, в равной мере действительной и используемой мерой зарегистрированных фотонов. Как правило, используется термин «электрон», хотя, в большинстве своем, матрицы ПЗС считывают количество генерируемых дырок, а не электронов). Поскольку матрицы ПЗС не обладают собственным коэффициентом усиления, на каждый зарегистрированный фотон образуется пара «электрон-дырка».

Динамический диапазон матрицы ПЗС, обычно, определяется, как полная емкость, деленная на шум камеры. Шум камеры определяется, как корень квадратный из суммы квадратов темнового шума и шума считывания. Следовательно, динамический диапазон матрицы ПЗС с полной емкостью в 49000 электронов, с шумом считывания, равным 10 электронам и пренебрежимо малым темновым шумом, равен, приблизительно 4900, что соответствует 12 разрядному выходному сигналу. Однако, преобразование выходного сигнала такой камеры в 12-разрядный код означает деление 49000 электронов на 4096 аналогово-цифровых единиц, по12 электронов каждая (49000/4096). Поскольку шумовая составляющая равна 10-и электронам, каждая градация яркости всего лишь в 1,2 раза превышает уровень шума, вследствие чего не может быть дискриминирована (распознана). Преобразование в 10-разрядный код дает аналогово-цифровые единицы емкостью по 49 электронов, что почти в пять раз выше уровня шума и позволяет дискриминировать все 1024 градации яркости. В таблице 2 представлены соотношения битовой глубины (разрядности цвета), градаций яркости и динамического диапазона (в децибелах) в пределах пяти порядков (100 000 крат).

Контроль скорости, эффективного размера пикселя и поля зрения

Цифровые камеры с низкой частотой сканирования (медленной разверткой) позволяют контролировать скорость считывания, эффективный размер пикселей, (образующих фотоприемник), и поле зрения. Научно-исследовательскиеПЗС-камеры, обычно, позволяют выполнять считывание на двух и более скоростях, благодаря чему можно найти компромисс между скоростью и шумом считывания. В большинстве камер с низкой частотой сканирования эффективный размер пикселя можно увеличивать за счет бининга, — процесса объединения зарядов соседних фотодиодов в кластер, сигнал которого обрабатывается, как сигнал, поступивший от фотоприемника большего размера.

Табл. 2 Динамический диапазон приборов с зарядовой связью

Бининг удобен при очень низких уровнях освещенности (малом количестве регистрируемых фотонов), поскольку позволяет повысить чувствительность, хотя бы и в ущерб пространственному разрешению. Кроме того, большинство ПЗС-камер с медленной разверткой позволяет производить считывание интересующей области изображения и игнорировать остальную часть накопленного заряда. Как правило, скорость пересылки кадров увеличивается пропорционально сокращению поля зрения. Например, матрица ПЗС с 1000×1000 фотодиодов обеспечивает выходную скорость 10 кадров/с, а при сокращении области считывания до 100×100 фотодиодов может выдавать 100 кадров/с. Находя компромисс между размерами поля зрения и скоростью передачи кадров, пользователь может приспособиться к более широкому кругу условий проведения эксперимента, чем это было бы возможно при использовании камеры с неизменной скоростью передачи кадров.

Цифровые камеры с электронно-оптическим преобразователем

Сегодня некоторые производители предлагают цифровые камеры, оснащенные электронно-оптическим преобразователем (усилителем яркости) изображения для съемки в условиях чрезвычайно низкой освещенности. В состав преобразователя входит фотокатод, расположенный в непосредственной близости к микроканальной пластине электронного умножителя, и фосфоресцирующий экран вывода (см. рисунок 5). Фотокатоды преобразователей последнего поколения имеют высокий квантовый выход (до 50%) в сине-зеленой области спектра. Коэффициент усиления преобразователя регулируется в широких пределах; типовой максимум равен 80000. Тепловой шум, создаваемый фотокатодом, и шум микроканальной пластины делают отношение С/Ш ПЗС-камеры с усилителем яркости изображения меньшим, чем у ПЗС-камеры с медленной разверткой. Разрешающая способность ПЗС-камеры с электронно-оптическим усилителем определяется этим усилителем и матрицей ПЗС, но, как правило, ограничивается геометрией микроканальной пластины, и составляет, приблизительно, 75% от разрешающей способности собственно матрицы ПЗС.

Рис. 8. Короткофокусный электронно-оптический преобразователь

По сравнению с камерами с медленной разверткой, цифровые камеры с ЭОП обладают более узким динамическим диапазоном (в том числе и внутрикадровым), а их разрешающая способность, в большинстве случаев, ограничивается 10-ю разрядами. Коэффициент усиления преобразователя можно быстро изменять соответственно изменениям яркости съемочного плана, с большим уровнем воспроизводимости результата, что расширяет межкадровый динамический диапазон.

Действительно, поскольку усилители яркости можно стробировать, т. е., включать и выключать в течение нескольких наносекунд, то для визуализации сравнительно ярких объектов время пребывания усилителя во включенном состоянии можно сократить. Цифровые камеры со стробируемым усилителем яркости изображения требуются для большинства приложений флуоресцентной микроскопии с разрешением по времени, поскольку коэффициент передачи фотоприемника можно с высокой частотой модулировать синхронно с источником света. По той причине, что для визуализации живых клеток требуются световые потоки низкой интенсивности, ПЗС-камеры с усилителем яркости часто используются для изучения динамических явлений и для визуализации и анализа соотношений.

Выбор камеры

Ни один отдельно взятый фотоприемник не соответствует всем требованиям флуоресцентной микроскопии, поэтому, исследователь вынужден идти на компромисс. Часто критическим параметром является время экспонирования (выдержка). При наличии достаточного времени для интегрирования, ПЗС-камера с медленной разверткой будет превосходить камеру с электронно-оптическим преобразователем по всем параметрам, главным образом, за счет более высокого квантового выхода и низкого уровня шумов. Охлаждение всегда улучшает параметры цифровой камеры, хотя, при времени интегрирования в несколько секунд, или менее, и при 8-12-разрядном выходном сигнале это улучшение может быть незаметным. Для приложений, в которых применяется цифровая деконволюция, следует выбрать охлаждаемую, с медленной разверткой камеру научно-исследовательского класса, способную формировать 14-16-разрядные изображения с высоким разрешением. Размер фотодиодов имеет значение, — фотодиоды некоторых матриц ПЗС настолько малы, что время интегрирования необходимо ограничивать, во избежание насыщения ячеек накопления заряда, что может привести к ухудшению динамического диапазона и пикового соотношения С/Ш. Для изучения быстрого, но точно прогнозируемого по времени начала явления, может подойти ПЗС-камера с медленной разверткой, работающая в режиме пикового импульса (вспышки) или в высокоскоростном режиме. Однако, если явление трудно предсказуемо, и для его регистрации необходимо непрерывно наблюдать образец в световом потоке низкой интенсивности, выбор следует остановить на ПЗС-камере с электронно-оптическим усилителем яркости изображения. Именно такие камеры используются для получения флуоресцентных изображений единичных молекул.

Рис. 9. Тонкий срез кишечника мыши (Флуоресцентное/фазово-контрастное изображение)

На рисунке 9 представлена микрофотография комбинированного эпифлуоресцентного/фазово-контрастного изображения тонкого среза кишечника мыши, трижды окрашенного несколькими флуоресцентными хромофорами. Для регистрации изображения использовался микроскоп Nikon Eclipse E600, аналогичный представленному на рисунке 1, оборудованный цифровой камерой Nikon DXM 1200. Для цветной съемки обычных гистологических образцов (препаратов) предпочтение следует отдать камере с трехэлементной матрицей ПЗС, вместо дешевой камеры с одним фотоэлементом и встроенной цветоделительной маской. В области светлопольной и флуоресцентной микроскопии очень хорошо зарекомендовали себя камеры высокого разрешения, с одноэлементной матрицей ПЗС, оснащенные съемным красно-зелено-синим жидкокристаллическим светофильтром.

Дальнейшие перспективы

Достижения последних лет в области совершенствования камер на базе КМОП-структур (комплементарных структур «металл-окисел-полупроводник») сделали серьезную заявку на использование в будущем этих устройств во флуоресцентной микроскопии. КМОП-камеры оснащаются встроенными в кристалл фотоприемника усилителем и аналого-цифровым преобразователем, которые связаны с каждым фотодиодом. В результате получается недорогое, компактное, универсальное средство регистрации, сочетающее в себе преимущества кремниевого фотоприемника с отсутствием проблем переноса заряда. Интерфейс КМОП-фотоприемника с компьютером дает возможность манипулировать отдельными фотодиодами, считывать интересующие области изображения, осуществлять высокоскоростную выборку, управлять электронной обтюрацией и форматом экспозиции. До недавнего времени недостатком таких фотоприемников считался высокий уровень шума с постоянным спектром, связанным с помехами коммутации и дискретизации. Однако, сегодня эти проблемы успешно решаются. Возможно, в ближайшем будущем такие устройства заменят ПЗС-фотоприемники в цифровых камерах, предназначенных для целого ряда научных приложений.

Заключение

Цифровой метод получения изображений предоставляет пользователю множество возможностей, включая простую в использовании аппаратуру, позволяющую легко сохранять, обрабатывать и использовать полученные изображения.

Разрешающая способность, скорость пересылки изображения и точность цветовоспроизведения — хорошие отправные точки при выборе цифровой камеры, однако, не менее важны хорошее программное обеспечение и простота в использовании. Простота цифровой съемки сделала получение высококачественных изображений доступным каждому.