RU EN

Цифровое формирование изображений – возможности микроскопии (III)

Источники шумов в ПЗС-камерах

Чувствительность камеры, в отношении минимально различимого сигнала, определяется флуктуационным фотонным (дробовым) шумом и электронными шумами, возникающими в матрице ПЗС. Консервативная оценка показывает, что выделить сигнал из сопутствующих шумов можно только тогда, когда амплитуда сигнала превышает амплитуду шумов, приблизительно, в 2,7 раза (отношение сигнал/шум равно 2,7). Минимальный сигнал, который может теоретически обеспечить данное отношение С/Ш, определяется случайными колебаниями потока фотонов, — связанным с сигналом источником собственного шума, существующего даже в случае идеального бесшумного фотоприемника. Интенсивность фотонного флуктуационного шума равна квадратному корню из количества сигнальных фотонов и, поскольку этот шум невозможно ликвидировать, именно он определяет максимально достижимое отношение сигнал/шум для бесшумного фотоприемника. Таким образом, отношение сигнал/шум определяется уровнем сигнала (S), деленным на корень квадратный из уровня сигнала (S(½)), и, следовательно, равно корню квадратному из S. Если для выделения сигнала из шумов требуется отношение сигнал/шум, равное 2,7, значит, теоретически различимый световой поток должен состоять, минимум, из 8-и фотонов.

На практике, к собственному флуктуационному фотонному шуму добавляются другие шумовые составляющие, не связанные с фотонным сигналом образца, и порождаемые матрицей ПЗС и электроникой камеры. Накопленный в потенциальной яме заряд, порожденный источниками шумов, невозможно отличить от сигнала, порожденного фотонами. Главным образом, шум системы состоит из шума усилителя считывания и шума, обусловленного образованием тепловых электронов в кремниевом кристалле фотоприемника. Тепловой шум связан с кинетическими колебаниями атомов кремния в подложке матрицы ПЗС. В результате этих колебаний электроны и дырки высвобождаются даже в полной темноте, и затем накапливаются в потенциальных ямах. Поэтому, такой шум называется темновым шумом, и представляет собой неопределенность в величине накопления темнового заряда за определенный промежуток времени. Скорость формирования темнового заряда, так называемый, темновой ток, не связан с фотонно-индуцируемым сигналом, и очень сильно зависит от температуры. Подобно фотонному шуму, темновой шум подчиняется статистической (через квадратный корень) связи с темновым током и, следовательно, его невозможно просто вычесть из сигнала. Охлаждение ПЗС-камеры на каждые 20 градусов Цельсия уменьшает накопление темнового заряда на порядок, поэтому, высококачественные камеры во время использования, обычно, охлаждаются. Охлаждение всего лишь до 0 градусов Цельсия дает весьма существенный эффект, а при -30 градусах Цельсия темновой ток уменьшается до пренебрежимо малой величины практически для любого применения в микроскопии.

Таким образом, в охлаждаемой камере остается еще одна из основных составляющих электронного шума — шум чтения, порождаемый, главным образом, находящимся на кристалле предварительным усилителем, в процессе преобразования носителей заряда в сигнал напряжения. Несмотря на то, что шум чтения поровну добавляется к каждому пикселю фотоприемника, точно определить его величину невозможно, — ее можно лишь аппроксимировать по среднему (среднеквадратичному) значению, выраженному в электронах на пиксель. Некоторые из видов шума усилителя считывания частотно-зависимы и, в общем случае, шум чтения увеличивается с увеличением скорости измерения заряда каждого из пикселей. Возрастание шума на высоких скоростях считывания и передачи кадров частично обусловлено необходимостью большей полосы пропускания усилителя на более высоких частотах тактирования пикселей. Охлаждение матрицы ПЗС, в некоторой степени снижает уровень шума усилителя считывания, но не до пренебрежимо малого уровня. Однако, в целый ряд конструкций современных высококачественных камер внесены улучшения, существенно снизившие значение шума чтения. Один из способов достижения высоких скоростей считывания и передачи кадров без повышения уровня шума, состоит в электрическом разделении матрицы ПЗС на два (или более) сегмента. Это позволяет сдвигать заряд в параллельном регистре к нескольким выходным усилителям, расположенным на противоположных краях или в углах кристалла. Такой метод дает возможность считывать заряд с матрицы с более высокой общей скоростью, без чрезмерного повышения скорости считывания (и шума) отдельных усилителей.

Рис. 1. Структура ПЗС-матрицы построчного переноса с микролинзами

Охлаждение ПЗС-камеры дает, помимо снижения уровня темнового шума, дополнительное преимущество, в виде улучшения эффективности переноса заряда (CTE) матрицы ПЗС. Этот параметр становится особенно важным в связи с широким использованием в современных устройствах формирования изображений матриц ПЗС больших размеров, а также благодаря росту скоростей считывания, необходимых для исследования быстрых динамических процессов. При каждом сдвиге зарядового пакета по каналам переноса, в процессе считывания матрицы ПЗС, небольшая часть заряда может оставаться не перемещенной. Несмотря на то, что, в большинстве случаев, потери переноса на каждом пикселе пренебрежимо малы, в результате очень большого числа переносов, особенно, в мегапиксельных фотоприемниках, у самых удаленных от усилителя (усилителей) считывания пикселей матрицы ПЗС могут произойти значительные потери, если эффективность переноса заряда недостаточно высока. Неполный перенос заряда может приводить к размыванию изображения, обусловленному смешением зарядов смежных пикселей. Кроме того, совокупное растекание (потери) заряда при перемещении каждого пикселя, особенно в больших матрицах, может стать причиной затенения изображения, когда самые удаленные от выходного усилителя матрицы ПЗС области изображения выглядят темнее, чем более близкие к последовательному регистру. Эффективность переноса заряда в охлаждаемых ПЗС-камерах может составлять 0,9999 и более. При таких значениях эффективности переноса влияние потерь на изображение, как правило, ничтожно, однако, значения ниже 0,999 вполне могут приводить к затенению.

Для компенсации затенения изображения существуют как аппаратные, так и программные методы. Программная коррекция осуществляется путем формирования изображения с однородным полем интенсивности, которое, затем, используется для создания попиксельной коррекционной карты. При помощи этой карты впоследствии можно исключать неоднородности изображений, обусловленные затенением. Обычно, методы программной коррекции дают удовлетворительные результаты в системах, не требующих исправления локальной интенсивности, более чем на 10–20%. Аппаратные методы, в том числе настройка коэффициентов передачи отдельных рядов пикселей, позволяют осуществлять более значительные исправления, вплоть до пятикратных. Необходимое значение коэффициента передачи определяется по интенсивностям контрольных сигналов от пяти-шести эталонных пикселей, расположенных вне области формирования изображения, в конце каждого ряда пикселей. Величины напряжения, полученные в результате обработки столбцов эталонных пикселей, расположенных на краю параллельного регистра, служат контрольными значениями потерь заряда при переносе. На их основе формируются поправочные коэффициенты для каждого ряда пикселей, которые применяются к напряжениям, полученным в результате считывания соответствующего ряда. У некоторых датчиков поправочные коэффициенты для определенных участков, например, для областей, удаленных от выходного усилителя в видеокамерах, достаточно велики. Кроме того, шумы в таких областях изображения могут достигать значительных уровней. Хотя, методы аппаратной коррекции и устраняют эффекты затенения без заметного ослабления сигнала, следует понимать, что результирующее отношение сигнал/шум для всего изображения будет неоднородным.

Пространственное и временное разрешение фотоприемников на матрицах ПЗС

Во многих случаях главным требованием, предъявляемым системе получения изображений, является ее способность обеспечивать высокое временнóе разрешение. Например, кинетика исследуемого процесса требует получения изображений со скоростью видеорежима и с умеренным разрешением. В этом случае, камера, обеспечивающая превосходное разрешение только в режиме медленной развертки, и плохо работающая, либо вовсе не работающая, в режиме высокоскоростной передачи кадров, окажется бесполезной. Полнокадровые камеры с медленной разверткой не обеспечивают высокое разрешение в режиме видеосъемки. Для формирования одного кадра, в случае большой матрицы пикселей, таким камерам требуется около одной секунды, в зависимости от скорости работы и разрядности цифро-аналогового преобразователя. В том случае, когда сигнал яркости образца имеет уровень, достаточный для съемки с короткими выдержками (порядка 10 миллисекунд), использование бининга и выделение субматрицы делает возможным съемку камерами с электромеханическими затворами со скоростью около 10 кадров в секунду, но с пониженным разрешением и меньшими размерами кадра. Для более высоких скоростей передачи кадров необходимо использовать камеры построчного или покадрового переноса, которым не нужны затворы. Помимо этого, такие камеры, как правило, быстрее выполняют цифро-аналоговое преобразование. Высокоскоростные камеры такой конструкции последнего поколения способны формировать полнокадровые изображения с 12-разрядным разрешением на скоростях, близких к скорости видеорежима.

Превосходное пространственное разрешение современных ПЗС-систем формирования изображений напрямую связано с размерами пикселей, и значительно улучшилось благодаря технологическим усовершенствованиям. Современные технологии позволили существенно уменьшить пиксели фотоприемников на ПЗС, не ухудшая другие их рабочие характеристики. В сравнении с размером зерен типичной фотопленки (около 10 мкм), пиксели многих ПЗС-камер, использующихся в биологической микроскопии, имеют меньшие размеры. В сочетании с широко использующимися объективами с большим увеличением, проецирующими на поверхность ПЗС-матрицы дифракционные круги (диски Эйри) сравнительно больших радиусов, такие фотоприемники обеспечивают более чем адекватное разрешение. Сегодня предлагаются ПЗС-камеры научно-исследовательского класса, с построчным переносом и размером пикселей менее 5 мкм, что делает их пригодными для получения изображений с высоким разрешением даже с объективами малого увеличения. В том случае, когда требуется сохранить пространственное разрешение оптической системы, важным критерием выбора цифровой камеры становится взаимосвязь размеров фотоэлемента и оптического разрешения.

Для определения адекватности размера пикселей фотоприемника разрешающей способности оптической системы микроскопа, обычно, используется критерий Найквиста. Согласно теореме Найквиста, чтобы сохранить оптическое разрешение и избежать наложения, наименьший радиус дифракционного кружка, который создается оптической системой, должен измеряться, минимум, двумя пикселями матрицы формирования изображения. В качестве примера рассмотрим ПЗС-пиксель с размерами 6,8×6,8 микрон, в сочетании со 100-кратным объективом с числовой апертурой 1,3, который формирует в плоскости фотоприемника дифракционное пятно с радиусом 26 микрометров. Такая комбинация фотоприемник-объектив позволяет получить превосходное разрешение, поскольку радиус дифракционного диска покрывает на матрице фотоприемника 4-пиксельный интервал (26 / 6,8 = 3,8 пикселя), что почти в два раза превышает ограничение по критерию Найквиста. При такой частоте дискретизации имеется достаточный запас, благодаря чему критерий Найквиста почти удовлетворяется даже с использованием бининга 2×2 пикселя.

Квантовый выход фотоприемника

Квантовый выход (QE) фотоприемника — это мера вероятности того, что фотон с определенной длиной волны будет поглощен активной областью устройства и высвободит носители заряда. Этот параметр характеризует эффективность генерирования заряда ПЗС-фотоприемником под действием падающих на него фотонов и, следовательно, является основным детерминантом минимально различимого камерой сигнала, в особенности, при визуализации в условиях низкой освещенности. В том случае, когда фотон не достигает обедненной области (слоя) полупроводника, или же проходит насквозь без передачи существенного количества энергии, заряд не образуется вообще. Характер взаимодействия фотона с фотоприемником зависит от энергии и, соответственно, длины волны фотона, и напрямую определяется областью спектральной чувствительности фотоприемника. Несмотря на то, что традиционные ПЗС-фотоприемники фронтального освещения высокочувствительны, ни один из них не обладает 100-процентным квантовым выходом ни на одной длине волны.

Типовые фотоприемники, использующиеся во флуоресцентной микроскопии, способны регистрировать фотоны в спектральном диапазоне 400–1100 нанометров, и имеют пик чувствительности в диапазоне 550–800 нанометров. Максимальный квантовый выход таких фотоприемников составляет не более 40–50%, за исключением новейших моделей, эффективность которых может достигать 80%. Рисунок 2 иллюстрирует спектральную чувствительность ряда популярных матриц ПЗС. На графике представлена зависимость квантового выхода от длины волны падающего света. Большинство из использующихся в научной сфере матриц ПЗС являются устройствами построчного переноса. Вследствие того, что межстрочная маска серьезно ограничивает площадь светочувствительной поверхности, многие ранние модели обладают очень низкими значениями квантового выхода. С появлением технологии поверхностных микролинз, позволяющих направлять больше падающего света на светочувствительные области между каналами переноса, новые построчные фотоприемники стали намного более эффективными, и многие из них имеют квантовый выход 60–70%.

Спектральный диапазон и квантовый выход некоторых высокоскоростных ПЗС-фотоприемников дополнительно улучшаются в ультрафиолетовой, видимой и ближней инфракрасной областях спектра путем различных конструкционных улучшений. Поскольку алюминиевые затворы каналов переноса обладают высокой поглощающей и отражающей способностью в синей и ультрафиолетовой областях спектра, во многих новых конструкциях используются другие материалы, например, оксид индия и олова, позволяющие улучшить светопропускание и квантовый выход в более широком спектральном диапазоне. Еще больший квантовый выход могут давать специальные матрицы ПЗС фотоприемников, предназначенные для освещения сзади, что позволяет полностью избежать размещения на рабочей поверхности светопоглощающей структуры электродов. В этих приборах бóльшая часть кремниевой подложки удаляется травлением и, хотя, в итоге, устройство получается хрупким и сравнительно дорогим, его типичный квантовый выход составляет около 90%.

Помимо всего перечисленного, для дополнительного улучшения спектральных характеристик могут использоваться другие методы обработки поверхности и конструкционные материалы. Для улучшения функциональных параметров матриц ПЗС с утонченной тыльной поверхностью в ультрафиолетовом диапазоне, используются специальные антиотражающие покрытия. Для улучшения квантового выхода в ближней инфракрасной области, в некоторых фотоприемниках используются модифицированные полупроводниковые материалы. Чувствительность матриц ПЗС фронтального освещения к излучению за пределами стандартного спектрального диапазона можно обеспечить путем нанесения на рабочую поверхность фотоприемника частотно-преобразующих люминофоров. Для этой цели выбираются люминофоры, поглощающие фотоны интересующего спектрального диапазона, и излучающие свет в диапазоне спектральной чувствительности матрицы ПЗС. Например, если образец исследуемого флуорофора излучает свет с длиной волны 300 нанометров (где чувствительность всех матриц ПЗС минимальна), на поверхность фотоприемника можно нанести преобразующий люминофор, эффективно поглощающий в диапазоне 300 нанометров и излучающий фотоны с длиной волны 560 нанометров, т. е., в диапазоне максимальной чувствительности матриц ПЗС.

Динамический диапазон

Под термином динамический диапазон ПЗС-фотоприемника понимается максимальное изменение интенсивности сигнала, которое может быть количественно интерпретировано этим фотоприемником. Большинством производителей ПЗС-камер динамический диапазон количественно определяется, как отношение полной емкости потенциальной ямы пикселя (FWC) к шуму чтения. Приведенное определение базируется на логическом обосновании, что это значение представляет собой ограничивающее условие, при котором внутрикадровая яркость изменяется в диапазоне, простирающемся от уровня практического насыщения пикселя до уровня, практически неразличимого под шумами. Динамический диапазон фотоприемника определяет максимальное количество разрешимых градаций яркости, на которые может быть разделен принятый сигнал. Чтобы в полной мере использовать динамический диапазон ПЗС-фотоприемника, целесообразно согласовать его с разрядностью аналого-цифрового преобразователя, что позволит получить максимально возможное количество градаций (уровней) яркости. Например, динамический диапазон камеры с полной емкостью потенциальной ямы в 16 000 электронов и шумом считывания в 10 электронов, равен 1600, и находится в промежутке между 10-разрядным11-разрядным А/Ц-преобразованием. Аналого-цифровые преобразователи с разрядностью 10 и 11 разрядов, способны распознать, соответственно, 1024 и 2048 градаций яркости. Поскольку, как определено выше, информационный бит может принимать только одно из двух возможных состояний, количество уровней интенсивности, которое может быть закодировано цифровым процессором (АЦП), отражает его разрешающую способность (битовую глубину), и определяется, как 2 в степени, равной значению заданной битовой глубины. Таким образом, 8, 10, 12 и 14-разрядные АЦП могут закодировать, максимум, 256, 1024, 4096 и 16384 уровней яркости, соответственно.

Определение динамического диапазона, как отношения полной емкости потенциальной ямы к шуму чтения, безусловно, не совсем реалистическая мера эффективного динамического диапазона, но весьма удобна для сравнения фотоприемников. На практике, эффективный динамический диапазон меньше этого отношения по двум следующим причинам: a) выходная характеристика ПЗС-фотоприемника становится нелинейной до того, как достигается полная емкость потенциальной ямы; b) сигнал с уровнем, равным шуму чтения, неприемлем визуально и практически бесполезен для количественных вычислений. Заметим, что максимальный динамический диапазон не эквивалентен максимально возможному отношению сигнал/шум, хотя это отношение тоже является функцией полной емкости потенциальной ямы. Фотонный флуктуационный шум, связанный с максимально возможным сигналом, или полной емкостью потенциальной ямы (FWC), равен квадратному корню из величины FWC, или 126 электронам для 16 000-электронной FWC из предыдущего примера. Таким образом, отношение сигнал/шум равно максимальному сигналу, деленному на шум (16,000/126), или 126-и — корню квадратному из собственно сигнала. Фотонный шум характеризует минимальный уровень собственных шумов. На практике зарегистрированный рассеянный свет и электронный (системный) шум уменьшают отношение сигнал/шум до значений, меньших 126, поскольку эти источники помех снижают эффективную величину FWC, добавляя в потенциальные ямы электроны, не являющиеся сигнальными.

Хотя, производитель мог бы стандартно оборудовать камеру с динамическим диапазоном около 4000, аналого-цифровым преобразователем, например, с 12-разрядным разрешением (4096 ступеней преобразования), в вопросе согласования динамического диапазона фотоприемника и разрядностью АЦП необходимо учитывать ряд релевантных факторов. Определенный по значениям FWC и шума чтения, динамический диапазон некоторых новейших ПЗС-камер с построчным переносом и 12-разрядным АЦП, составляет, приблизительно, 2000. Однако, многие современные модели позволяют устанавливать коэффициент передачи, равный 0,5x, что дает возможность полностью использовать 12-разрядное разрешение. Этот метод основывается на том, что пиксели последовательного регистра имеют удвоенную, в сравнении с пикселями параллельного регистра, электронную емкость. Поэтому, выбрав для камеры режим бининга 2×2 (общепринятый режим во флуоресцентной микроскопии), можно получать высококачественные изображения с 12-разрядным разрешением.

Чтобы успешно использовать доступную битовую глубину преобразователя, важно знать различные механизмы манипулирования коэффициентом передачи электронной системы. А сравнивая динамические диапазоны разных камер, лучше всего вычислить их, исходя из величины полной емкости потенциальной ямы и шума чтения соответствующей камеры. Камера, оснащенная электронной системой, обладающей цифровым разрешением, намного бóльшим, чем того требует внутренний динамический диапазон камеры, стала обычным явлением. Использование таких камер со стандартным единичным (1x) коэффициентом передачи электронной системы ведет к потенциально большему количеству неиспользуемых уровней яркости, из тех, которые может обеспечить аналого-цифровой преобразователь. В принципе, изготовитель камеры может реализовать в ней непредусмотренный коэффициент передачи, равный 2-4x, что может быть неочевидно для пользователя. И, хотя, с целью использования всей разрядности АЦП, такой метод повышает уровень сигнала, он создает повышенный уровень шумов аналого-цифрового преобразования, поскольку снижает количество сигнальных электронов, определяющих каждый из уровней яркости.

Ввиду того, что устройства отображения, например, мониторы компьютеров и многие принтеры обеспечивают только 8-разрядное разрешение, воспроизводя 256 уровней яркости, а другие печатные средства массовой информации, как и человеческий глаз, способны только на 5-7-разрядное разрешение, потребность в ПЗС-камерах с большой битовой глубиной может показаться сомнительной. Несмотря на столь низкие требования к визуализации, обладающие большой глубиной цвета и широким динамическим диапазоном камеры всегда будут предпочтительны и необходимы для определенных приложений, в частности, для флуоресцентной микроскопии. Большое количество уровней яркости позволяет более точно определять значения интенсивности при обработке данных визуализации, полученных в ходе количественных экспериментов с анализом относительных или кинетических процессов. Кроме того, подвергаясь множеству операций по обработке изображений, данные визуализации, имеющие более точное разрешение по большому количеству уровней яркости, могут выдерживать значительно больше математических манипуляций, без проявления ухудшения из-за арифметических погрешностей округления.

Третье преимущество систем с большой разрядностью визуализации становится понятным, когда для отображения выбирается часть полученного изображения, и область интереса охватывает только часть всего динамического диапазона изображения. С целью оптимизации представления ограниченного динамического диапазона, исходное количество уровней яркости, обычно, расширяется, чтобы охватить все 256 градаций 8-разрядного монитора или принтера. Бóльшая битовая глубина камеры ведет к менее экстремальному расширению и, соответственно, меньшему ухудшению качества изображения. Например, если выбранный участок изображения охватывает только 5% полного внутрикадрового динамического диапазона, это будет представлять более 200 уровней яркости из 4096, дискриминируемых 12-разрядным АЦП, и, всего лишь, 12 градаций 8-разрядной (256-уровневой) системы. В случае отображения на мониторе или печати на принтере, с использованием 256 уровней яркости, расширенное до такой степени изображение с 12-разрядным разрешением по яркости, выглядело бы «пикселизированным», с блочными или контурными яркостными переходами, а не с плавными градациями яркости.

Цветные фотоприемники на матрицах ПЗС

Хотя, по своей природе, ПЗС нечувствительны к цвету, для получения цветных изображений при помощи ПЗС-камер, (с целью визуализации внешнего вида образца в микроскопе) используются три различных метода. Прежние технические трудности отображения и печати цветных изображений перестали быть проблемой, а увеличение объема информации, которую дает цветное изображение, может быть весьма значительным. Многие приложения, например, флуоресцентная микроскопия, изучение окрашенных гистологических и патологических срезов тканей, а также наблюдение других меченых образцов, с использованием методов светлого поля или дифференциально-интерференционного контраста, основывается на цвете, как неотъемлемом компоненте изображения. Для получения цветных изображений при помощи ПЗС-камеры, требуется, при помощи цветных светофильтров, разделить красную, зеленую и синюю спектральные составляющие светового потока, по отдельности зарегистрировать эти составляющие и, затем, объединить их в составное цветное изображение.

Каждый из методов распознавания цвета имеет сильные и слабые стороны, но все они ограничивают скорость, ухудшают временнóе и пространственное разрешение, сужают динамический диапазон и повышают уровень шумов в цветных камерах, по сравнению с полутоновыми камерами. Наиболее распространенный метод состоит в установке на матрицу ПЗС маски с чередующимися красными, зелеными и синими (RGB) микролинзами-светофильтрами, расположенными в виде мозаичного шаблона Байера. В конструкции с тремя кристаллами изображение разделяется светоделительной призмой и цветными светофильтрами на три составляющих (RGB), которые регистрируются отдельными матрицами ПЗС, из выходных сигналов которых воссоздается цветное изображение. Третий метод заключается в чередовании кадров, когда одна матрица ПЗС используется для последовательного получения отдельных изображений каждого цвета, за счет смены цветных светофильтров, расположенных в осветительной оптической системе либо перед фотоприемником.

Рис. 2. Спектральная чувствительность ПЗС научного уровня

В большинстве цветных камер для микроскопии используются однокристальные матрицы ПЗС с присоединенными матрицами цветных светофильтров. Матрица фильтров состоит из красных, зеленых и синих микролинз, установленных на отдельные пиксели в виде регулярной структуры. Мозаичный светофильтр Байера распределяет цветовую информацию по четырехпиксельным светочувствительным модулям, в состав каждого из которых входит один красный, один синий и два зеленых светофильтра. Зеленый цвет выделяется в характере распределения с целью лучшего соответствия зрительной чувствительности человека, а деление цветовой информации среди групп из четырех пикселей весьма умеренно ухудшает разрешение. Зрительная система человека воспринимает пространственные детали, главным образом, через составляющие сигналов яркости, а эта информация содержится в каждом пикселе, независимо от цвета. Зрительно удовлетворительные изображения получаются путем объединения цветовой информации, имеющей более низкое пространственное разрешение, и имеющих высокое разрешение монохроматических структурных деталей.

Существует уникальная конструкция цветных камер с одной матрицей ПЗС, которая улучшает пространственное разрешение, слегка сдвигая матрицу ПЗС между последовательными операциями получения цветных составляющих изображения, а затем интерполирует эти составляющие (прием, называемый сдвиг пикселей), хотя это весьма существенно замедляет процесс. Другой метод индивидуального маскирования пикселей состоит в быстром перемещении матрицы цветных микролинз в виде квадрата, непосредственно по поверхности матрицы ПЗС в процессе регистрации фотонов. И, наконец, недавно представленная технология объединяет в каждом из пикселей три потенциальные ямы различной глубины для фотоэлектронов, позволяющие дискриминировать фотоны по длине волны. Этот метод обеспечивает максимальное пространственное разрешение, поскольку каждый пиксель содержит информацию о красном, зеленом и синем цвете.

Трехкристальная камера объединяет в себе высокое пространственное разрешение с высокой скоростью получения изображений, что обеспечивает высокую скорость передачи кадров, пригодную для получения высокоскоростных последовательностей изображений и реализации видеовыхода. Использование светоделителя для направления сигнала на три матрицы ПЗС, которые, за счет использования соответствующих светофильтров, одновременно регистрируют красную, зеленую и синюю составляющие изображения, позволяет производить съемку с очень высокой скоростью. Однако, по причине того, что интенсивность света, попадающего на каждую из матриц ПЗС, существенно снижается, объединенное цветное изображение получается намного более темным, чем монохроматическое изображение, полученное с помощью однокристальной камеры при сравнимой выдержке. Повысить яркость такого цветного изображения можно за счет увеличения коэффициента передачи, но при этом ухудшается отношение сигнал/шум и на изображениях становятся более заметными искажения. Пространственное разрешение трехкристальной камеры может быть выше пространственного разрешения отдельно взятых ее матриц ПЗС, если каждая из этих матриц смещена на субпиксельное расстояние относительно двух других. Поскольку, при этом, красное, зеленое и синее изображения представляют несколько разные выборки, их можно объединить при помощи ПО камеры, и получить составное изображение с высоким разрешением. Многие приложения в микроскопии и других областях науки, где требуется высокое пространственное и временнóе разрешение, выигрывают от использования камер с тремя матрицами ПЗС.

Цветные камеры с так называемым чередованием кадров оснащаются автоматическим диском со светофильтрами или жидкокристаллическим перестраиваемым фильтром (LCTF), для последовательного получения красной, зеленой и синей составляющих изображения на одной матрице ПЗС. Поскольку для получения всех составляющих изображения — красной, зеленой и синей, используется один и тот же фотоприемник, сохраняется его полное пространственное разрешение, а регистрация изображения происходит автоматически. Последовательное получение трех кадров замедляет процесс съемки и отображения изображения, а для достижения правильного цветового баланса, часто, каждому из трех цветовых составляющих требуется собственное время интеграции. Хотя, камеры такого типа, как правило, не подходят для высокоскоростного формирования и передачи кадров, использование быстродействующих жидкокристаллических настраиваемых фильтров для R-G-B последовательности может существенно повысить их рабочую скорость. В некоторых приложениях необходимо учитывать поляризационные характеристики фильтров LCTF, поскольку эти фильтры пропускают только один вектор поляризации, и при наблюдении в поляризованном свете могут изменять цвета образцов, способных к двойному лучепреломлению.

Цветовой баланс в цифровых системах формирования изображений

Получение точно сбалансированных цветных изображений в оптическом микроскопе может оказаться сложной задачей даже для опытного специалиста, независимо от того, какую камеру он использует — с традиционной фотопленкой, или новейшую полупроводниковую цифровую систему визуализации. Использование электронной аппаратуры для получения изображений основывается на тех же известных свойствах света, на которых базируется традиционная микрофотография со съемкой на фотопленку. Однако, возможность осуществлять настройку баланса белого для достижения цветового баланса изображения является уникальным свойством электронных формирователей изображения, не вполне интуитивно понятным для исследователя, стремящегося получить цифровые снимки из микроскопа.

Рис. 3. Коррекция баланса белого с 3200К до 5600K для освещения

При критическом сравнении изображения, сформированного цифровым способом и наблюдаемого в окуляры микроскопа, или «живого изображения» — на мониторе компьютера, цветовые отклонения, зачастую, поражают, а попытки устранить различия могут оказаться тщетными. Одна из причин такого различия состоит в том, что в процессе формирования изображения происходит значительная подсознательная аккомодация зрительной системы человека к изменениям условий визуализации, а проблемы цветопередачи, обычно, не осознаются до момента регистрации и оценки статической версии изображения, часто в различных условиях просмотра.

На рисунке 3 представлена серия цифровых изображений, снятых в поле зрения одного микроскопа при различных цветовых температурах освещения. В качестве образца выбрана монослойная культура адгезивных клеток фибробласта кожи индийского оленя-мунтжака, наблюдаемых по методу дифференциально-интерференционного контраста (ДИК), со сравнительно малым (одна двенадцатая длины волны) сдвиговым замедлением. В том случае, когда призма Номарского настроена на достижение показанной на рисунке 1 разности длин оптических путей, а на пути светового потока установлен светофильтр, повышающий цветовую температуру вольфрамово-галогенной лампы, приблизительно, с 3200K до 5500K (дневной свет), в окулярах микроскопа культура выглядит окрашенной в нейтральный серый цвет.

Без светофильтра-преобразователя, ДИК-образец на рисунке 3 выглядит нейтрально-серым, но при наблюдении через окуляры микроскопа демонстрирует глобальный желтый оттенок, характерный при освещении лампами накаливания. На снимке, сделанном цифровой камерой с выключенной функцией баланса белого, и установленной в описанную конфигурацию микроскопа, все изображение также имеет желтый оттенок (рисунок 3(a)). Установленный в оптическую систему цветоконверсионный светофильтр окрашивает изображение образца в окулярах в легкий голубоватый тон, а соответствующие цифровые изображения, полученные без коррекции баланса белого, сохраняют или усиливают этот цветовой сдвиг (рисунок 3©). Применение алгоритмов коррекции баланса белого к изображениям, полученным при освещении лампами накаливания или при дневном свете, устраняют затенение, вызванное эффектами цветовой температуры (см. рисунок 3(b)). Следует отметить, что для получения изображения со сбалансированным тональным качеством, алгоритм коррекции использует разные корректирующие значения, определяемые цветовой температурой освещения. Освещение вольфрамовой лампой накаливания требует увеличения синей и уменьшения красной составляющих спектра, а для дневного света справедливо обратное.

Достижение правильного цветового баланса изображений, получаемых при помощи цифровых камер, работающих совместно с оптическими микроскопами, зависит от целого ряда факторов, и начинается с установления правильного режима освещения и точной юстировки микроскопа, достигая кульминации на этапе формирования изображения. Настройка баланса белого для получения требуемого изображения играет исключительно важную роль. Эту функцию можно использовать двояко, — как для наиболее достоверного воспроизведения изображения образца, так и для намеренного изменения данного изображения, с целью устранения паразитных цветовых оттенков, появляющихся в результате подготовки образца в процессе исследования.

Концептуально, предварительная (грубая) настройка баланса белого нужна для приведения выходного сигнала фотоприемника в соответствующий диапазон, соответственно общим условиям освещения (подобно выбору типа пленки). Точная настройка чем-то похожа на использование цветовых корректирующих светофильтров в пленочной фотографии. Даже если источник освещения и характеристика фотоприемника согласованы, свет, проходя через микроскоп, обычно, изменяется образцом и другими элементами оптической системы, причем, такие изменения, в некоторой степени, непредсказуемы. Поэтому, цветовой баланс окончательного изображения может отличаться от требуемого результата. Очень важно понимать, что различные образцы и, возможно, локальные участки образца, уникальным образом влияют на формирующий изображение световой пучок. Таким образом, при необходимости иметь точный цветовой баланс, такие параметры, как настройка баланса белого необходимо тщательно контролировать.

Общая концепция цветового баланса изображений

Формирование изображения в оптической микроскопии основывается на фундаментальных свойствах света, включая интенсивность и спектральные характеристики, создающие зрительно воспринимаемый цвет, а также, связанное с этими характеристиками, значение цветовой температуры. Цветовую температуру можно точно определить и инструментально измерить относительно стандартного эталонного источника освещения. Однако, невозможно достоверно предсказать, как будет выглядеть каждый образец при данных параметрах визуализации. Более того, источники света с одинаковой цветовой температурой могут резко различаться по спектральному составу и формировать, в значительной степени, различные изображения при одинаковых условиях наблюдения. Ситуация осложняется широким спектром эффектов, которые могут привноситься в оптическую систему микроскопа дополнительными средствами улучшения контрастности. Светлое поле, темное поле, фазовый контраст, ДИК, поляризованный свет, модуляционный контраст Хоффмана и флуоресцентное освещение — все перечисленные методы проявляют необходимость применения корректировки цветового баланса, зачастую, индивидуально для образца и условий освещения.

84.jpg

Рис. 4. Ошибки баланса белого при использовании методов улучшения контрастности

На рисунке 4 представлено несколько цифровых изображений, полученных при различных значения цветовой температуры и методах улучшения контрастности. На рисунке 4(a) показан окрашенный эозином и гематоксилином тонкий срез тестикулярного рака человека (семиномы) в вольфрамово-галогенном освещении. Видно, что общий желтый тон, распространяющийся по всему изображению и проявляющий окрашенные фрагменты, не соответствует изображению с правильным цветовым балансом. Это распространенная ошибка, возникающая в светлопольной микроскопии тогда, когда на оптическом пути света не устанавливается цветной светофильтр преобразования дневного света. Введение в оптический путь синего фильтра дневного света, без коррекции баланса белого цифровой камеры, может привести к окрашиванию всего цифрового изображения в голубоватые тона (см. рисунок 4(b)). Представленное изображение монослойной культуры живых клеток HeLa демонстрирует синий оттенок, возникающий при неправильном цветовом балансе камеры. Применение алгоритмов баланса белого в программном обеспечении для получения изображений дает изображение в оттенках серого, наблюдаемое в окулярах микроскопа.

В том случае, когда освещение микроскопа не сбалансировано до цветовой температуры дневного света, а в камере неправильно настроен баланс белого, описанные проблемы характерны для изображений, полученных и по другим методам улучшения контрастности. На рисунках 4(с), 4(d) и 4(e) представлены изображения, полученные, соответственно, по методу дифференциально-интерференционного контраста (ДИК), в поляризованном свете и с использованием модуляционного контраста Хоффмана. На всех изображениях значения цветового баланса сдвинуты в сторону теплых (желтых) тонов. На изображении, полученном по методу дифференциально-интерференционного контраста (рисунок 4(с)), детали выглядят грязноватыми, а обычные серые тона представлены различными оттенками коричневого и красного. Аналогично, изображение рекристаллизованной мочевины в поляризованном свете (рисунок 4(d)) выглядит чрезмерно зеленым, а полученное по методу модуляционного контраста Хоффмана изображение радиолярии (рисунок 4(e)) имеет, несомненно, зеленый фон (и блики). Флуоресцентные изображения (рисунок 4(f)), обычно, не создают проблем с цветовым балансом, главным образом, потому, что ограничены узким диапазоном длин волн.

Феномен изменения цветового баланса или цветопередачи хорошо знаком большинству людей по повседневной деятельности и, обычно, воспринимается, как естественное явление, не требующее никакого вмешательства.

Например, всем хорошо знаком золотистый тон дневного света вблизи заходящего солнца, как и тот факт, что одни и те же цвета при свете свечи и во флуоресцентном офисном освещении существенно отличаются. Зрительный аппарат человека объединяет сенсорную реакцию глаз с интерпретацией сигналов мозгом и, тем самым, согласует изменения спектрального состава и интенсивности света. В результате, белые объекты интерпретируются, как белые, в широком спектре режимов освещения. Как правило, если белый цвет воспринимается правильно, то остальные цвета и оттенки тоже интерпретируются верно. И, напротив, формирователи изображений, будь то традиционная фотопленка или современная цифровая фотокамера, реагируют (формируют ответный сигнал) на фиксированное освещение в момент экспонирования. Качество воспроизведения цвета на формируемом изображении зависит от конкретной реакции цветочувствительных слоев фотопленки или от чувствительности отдельных цветовоспринимающих элементов (пикселей) твердотельного (полупроводникового) фотоэлемента. При обоих методах съемки цветовой баланс изображения можно изменять за счет установки цветофильтров в осветительную или формирующую изображение оптическую систему. Однако, цифровой метод обладает особым дополнительным преимуществом — возможностью прецизионной электронной настройки выходного сигнала фотоприемника.

Основы настройки баланса белого в цифровой камере

Воспринимающий элемент, использующийся для регистрации изображений, будь то традиционная фотопленка, или цифровое устройство формирования изображений, в общем случае, конструируются или настраиваются так, чтобы их базовая реакция соответствовала основным категориям освещения. Фотографические пленки, например, выпускаются в двух основных вариантах, — для дневного света и для освещения, создаваемого вольфрамовыми лампами накаливания. Точная настройка реакции пленки для критических приложений осуществляется за счет использования соответствующих светофильтров. Характеристики чувствительности твердотельных фотоприемников, которыми, обычно, являются приборы с зарядовой связью (ПЗС) или комплементарные металл-оксид-полупроводниковые (КМОП) фотодиодные приемники, можно электронным способом настроить на соответствие самым различным источникам освещения.

Отдельные светочувствительные элементы ПЗС или КМОП фотоприемников по своей природе монохромны. Их чувствительность к цвету достигается за счет последовательного пропускания падающего света через красный, зеленый и синий светофильтры на всю поверхность фотоприемника. В результате получаются отдельные изображения для каждого цвета, которые затем объединяются. Или же, падающий свет пропускается через миниатюрные тонкопленочные полимерные фильтры, которые размещаются в мозаичном порядке поверх каждого пикселя матрицы. Наиболее часто фильтры располагаются в виде упорядоченной мозаичной матрицы красных, зеленых и синих фильтрующих элементов, с повторяющейся G-R-G-B последовательностью, над всей матрицей светочувствительных элементов. Такое расположение, называемое фильтрующей мозаикой Байера (см. рисунок 5(a)), содержит удвоенное, по отношению к красным и синим, количество зеленых светофильтров. Дополнительные зеленые пиксели позволяют приблизить цветочувствительность фотоприемника к цветочувствительности зрительного аппарата человека, пик которой приходится на зеленую область спектра (на волну с длиной около 550 нанометров; рисунок 5(b)) и, таким образом, облегчают получение изображений с визуально приемлемым цветовым балансом. Индивидуальная настройка амплитуд красного, зеленого и синего сигналов от соответствующих пикселей (или одноцветных изображений) светочувствительной матрицы осуществляется за счет функции контроля баланса белого, позволяющей достичь правильного цветового баланса формируемого изображения. В некоторых камерах описанные настройки и регулировки выполняются программно, вместо аппаратного способа, либо совместно с ним.

84.1.jpg

Рис. 5. Мозаичная структура фильтрующей матрицы Байера и спектральные кривые

Несмотря на то, что хорошо знакомые многим микроскопистам цифровые камеры общего назначения обладают, как правило, несколько ограниченными возможностями, они все шире адаптируются для установки на микроскопы, в качестве экономичной альтернативы специализированным системам получения изображений научно-исследовательского класса. Поскольку методики использования цифровых камер для общепринятых целей можно распространить на понимание таких факторов, как настройка баланса белого в применении к микроскопии, целесообразно сначала рассмотреть нетехнические аспекты. Основные положения, относящиеся к настройке баланса белого в общих фотографических приложениях и для получения изображений в микроскопии, одинаковы.

Обычно, стандартные цифровые камеры предоставляют пользователю ряд различных вариантов настройки баланса белого в виде выбираемых «предварительно заданных установок». Такие предварительно заданные установки (далее, для краткости, «предустановки») могут соответствовать различным категориям освещения, например, дневному (в солнечную или облачную погоду), от ламп накаливания, флуоресцентному, либо иным вариантам. Многие камеры позволяют выполнять точную настройку предустановленных значений, что позволяет достичь более точного цветового баланса изображений. Некоторые камеры предоставляют дополнительную возможность настроить баланс белого по белой карточке, стене или иному объекту, который, будучи включенным в изображение, должен представляться белым. На практике, камера располагается так, что белый объект заполняет поле зрения, а настройка баланса белого инициируется установкой переключателя, либо, выбором параметра в меню настройки (в зависимости от конкретной камеры), после чего система настраивает фотоприемник камеры на воспроизведение упомянутого объекта, как белого.

Настройка по определенному белому объекту выполняется в тех же условиях освещения, в которых проводится съемка, и способна обеспечить высокоточную калибровку цветового баланса. Однако, при изменении освещения описанную процедуру необходимо повторить. Опытные фотографы, чтобы достичь желаемого эстетического эффекта, часто видоизменяют свои снимки, используя несоответствующие освещению настройки баланса белого. Например, тон изображения можно сделать холоднее или теплее того, который оно имело бы при съемке с «правильным» балансом белого. Если цель состоит в точном воспроизведении объекта съемки, такие эффекты, разумеется, рассматриваются, как ошибки, аналогичные использованию пленки, сбалансированной для дневного освещения, в условиях освещения лампами накаливания, и наоборот.

Популярный метод достижения цветового баланса, которого следует избегать в критически важных случаях, в бытовых камерах называется «автоматическая настройка баланса белого». Этот метод предназначен для применения к полю изображения в процессе съемки, и представляет собой оценку всего поля зрения, усреднение текущих экспозиционных чисел по цветовым оттенкам и попытку усреднить, или исключить, любое результирующее искажение цвета. Недостаток метода автоматической балансировки состоит в том, что имеющиеся в любом поле зрения значения цветовой интенсивности представляют собой «усредненное» распределение цвета, которое комбинируется для формирования нейтрального серого или белого оттенка. В действительности, когда суммарный отклик пикселей не аналогичен запрограммированному (расчетному) общему среднему, выполненная камерой настройка баланса белого не даст точного воспроизведения цвета.

Типичные образцы, наблюдаемые в микроскоп, весьма сильно различаются по цветовому распределению и часто проявляют один, преобладающий цвет (особенно, при флуоресценции). Весьма вероятно, что автоматическая настройка баланса белого на образце, проявляющем превалирующую красную окраску (например, биологической ткани), будет давать цветовой баланс, существенно отличный от полученного с использованием той же процедуры на окрашенном в белый цвет препарате. Вероятнее всего, ни в том, ни в другом случае точное представление образца получить не удастся. Попытки сбалансировать выходную характеристику фотоприемника на усредненный результирующий цветовой тон (значение) будут давать существенно различные результаты на различных образцах, в особенности, когда данное поле зрения окрашено в резкие или доминирующие цвета. Разумеется, существуют образцы, дающие приемлемые результаты с автоматической настройкой баланса белого (вероятнее всего, с большой долей белых или серых участков), однако, для повсеместного использования, такой методике недостает воспроизводимости результатов.

Методы настройки баланса белого в микроскопии

Из рассмотрения различных вышеупомянутых методов оптимизации баланса белого становится очевидным, что некоторые из них не удовлетворяют ограничениям и требованиям оптической микроскопии. Использование предустановленных значений для конкретных типов освещения предполагает, что характеристики источника света неизменны и имеют стандартные значения цветовой температуры и других спектральных параметров. При использовании в микроскопии вольфрамово-галогенных ламп, общепринято варьировать напряжение их питания, с целью управления интенсивностью света или для минимизации тепловыделения. При этом происходят изменения цветовой температуры освещения, ведущие к неправильному цветовому балансу, если для цифровой камеры используется стандартное предустановленное значение для освещения вольфрамовыми лампами. Дополнительным источником непостоянства цветопередачи являются изменения цветовых характеристик лампы, вызванные ее старением на протяжении срока эксплуатации.

Аналогичные проблемы имеют место при использовании источников света, оптимизированных в диапазоне цветовых температур дневного освещения (около 5500K). И не только потому, что цветовая температура «дневного света» непостоянна, но и в силу крайне ограниченного числа источников, в точности имитирующих спектральные характеристики дневного света. Теоретически, эти трудности, по крайней мере, частично, можно преодолеть за счет автоматической коррекции минимальных флуктуаций освещения, однако, зачастую, другие проблемы делают такой подход нежелательным. При автоматической оценке поля изображения, локализованные неоднородности образца могут порождать существенные нарушения цветового баланса. В общем случае, наилучший подход для большинства приложений микроскопии состоит в ограничении оценки баланса белого тщательно выбранной областью изображения или другим подходящим эталоном.

84.2.jpg

Рис. 6 Выделение точки и области для настройки баланса белого

Как правило, основная цель использования цифровых устройств для получения цветных изображений в микроскопии состоит в получении правильного цветового баланса, с целью верного изображения образца. Умышленные отступления от этого принципа делаются, обычно, для того, чтобы исправить нежелательные цветовые оттенки, возникающие в результате препарирования образца. В большинстве своем, цифровые камеры научно-исследовательского уровня, включая специально предназначенные для микроскопии, рассчитаны на настройку баланса белого по соотнесению с некоторым фиксированным цветовым значением. В случае освещения проходящим светом, выбирается подходящий участок поля образца (обычно, белый или нейтрально-серый), или же, настройка производится только по освещенному полю, без образца в оптическом пути света. Для настройки баланса белого в микроскопии с отраженным светом, вместо образца на предметный столик микроскопа можно поместить белую или нейтрально-серую карточку (или кусочек бумаги). Настройка баланса белого выполняется путем измерения света, отраженного от поверхности белой карточки.

В большинстве своем, цифровые камеры для микроскопии управляются программой, установленной на главном компьютере и, зачастую, настроены на взаимодействие с рядом функций микроскопа. Например, в отношении способа достижения баланса белого, программный интерфейс для цифровой камеры Nikon DXM 1200 типичен для предлагающихся сегодня коммерческих продуктов. В активированном окне (пользовательского интерфейса) настройки баланса белого становятся доступными варианты выбора области поля зрения для оценки этого баланса управляющей системой камеры. «Живое» изображение на дисплее монитора необходимо тщательно оценить на предмет соответствующей белой или нейтрально-серой области, которая будет служить эталоном для фотоприемника формирователя изображений. В том случае, когда цветовые оттенки изображения на мониторе отличаются от цветового баланса, наблюдаемого в окулярах микроскопа, баланс белого камеры необходимо настроить так, чтобы изображение образца было точным. В идеальном случае, при выборе правильной области образца (для настройки баланса белого), система настройка баланса белого камеры уберет паразитный цветовой оттенок с изображения на мониторе.

На рисунке 6 представлено несколько типичных примеров областей образцов, которые можно использовать для настройки алгоритмов регулировки баланса белого цифровой камеры. В качестве образцов использованы: живая культура фибробластов, визуализированная по методу дифференциально-интерференционного контраста (рисунок 6(a)), четырехкратно окрашенный тонкий срез крахмальных зерен в ткани картофеля в светлопольном освещении (рисунок 6(b)), и эритроциты человека, визуализированные по методу фазового контраста (рисунок 6(с)). На всех изображениях, участки, пригодные для настройки баланса белого по вышеупомянутому методу, очерчены красными прямоугольниками. Желтые стрелки указывают те точки изображений, которые могут обеспечить удовлетворительную калибровку баланса белого при выборе единичного пикселя.


Почему стоит работать с нами?

Комплексные поставки медицинского оборудования и мед. изделий
Прямые контракты с производителями - поставки оборудования на оптимальных условиях
Устойчивое финансовое положение позволяет участвовать в торгах любого объема
Широкая номенклатура товаров - более 3000 наименований товара на складе
Спонсорская поддержка наших партнеров и агентов
Богатый международный опыт поставок - торговые представительства в 50 странах мира

Связь со специалистом

Запросить цену

Заказать сервис

Отправить резюме

Подписаться на рассылку

Запросить коммерческое предложение