RU EN

Метод дифференциально-интерференционного контраста (I)

Компенсаторы Сенармона в ДИК-микроскопии

В традиционных микроскопах, работающих по методу дифференциально-интерференционного контраста (ДИК) сдвиг лучей реализуется в оптической системе введением одной из согласованных призм (с конденсором или объективом) — призмы Номарского или модифицированной призмы Волластона, которые устанавливаются перпендикулярно оптической оси микроскопа для создания разности длин оптических путей. Тот же эффект можно получить при использовании неподвижной призмы Номарского и компенсатора Сенармона, состоящего из четвертьволновой фазовой пластинки в сочетании с поляризатором или анализатором.

Рис. 1. Конфигурация ДИК-микроскопа с компенсатором Сенармона

Базовая конфигурация современного прямого микроскопа показана на рисунке 1 (микроскоп Nikon серии Eclipse E600). Поляризатор и четвертьволновая пластинка смонтированы в общем корпусе, который крепится установочным винтом в основной световой порт микроскопа. После установки в заданное положение, отклоняющая пластинка остается в предварительно выставленном положении, тогда как поляризатор можно поворачивать на 90 градусов (+ 45 градусов) вокруг оптической оси микроскопа. В зависимости от ориентации поляризатора относительно отклоняющей пластинки, компенсатор Сенармона освещает оптическую систему микроскопа светом с линейной, эллиптической или круговой поляризацией.

Поляризованный волновой фронт, выходящий из компенсатора Сенармона, сначала попадает на неподвижную призму Номарского, установленную в блоке конденсора (см. рисунок 1), после чего перенаправляется и расщепляется на ортогональные составляющие (обыкновенный и необыкновенный волновые фронты), колебания в которых направлены под углом 45 градусов к поляризованному свету, выходящему их компенсатора Сенармона. Система линз конденсора фокусирует расщепленные волновые фронты в параллельные лучи и проецирует их на образец. Вышедший из образца свет собирается объективом и фокусируется в интерференционной плоскости второй призмы Номарского, которая расположена в револьверном держателе микроскопа. Расположенная в держателе объектива и согласованная с призмой конденсора вторая призма Номарского соединяет расщепленные лучи в коаксиальные ортогональные составляющие. Хотя линейно-поляризованный свет, выходящий из второй призмы Номарского, блокируется анализатором, эллиптически и циркулярно-поляризованный свет способен проходить сквозь компоненты оптической системы и формировать изображение образца.

Впервые метод дифференциально-интерференционной микроскопии был разработан и предложен Френсисом Смитом (Francis Smith) в 1955 году. Смит сконструировал модифицированный поляризационный микроскоп, установив в передней фокальной плоскости конденсора и в задней фокальной плоскости объектива призмы Волластона. Из-за конструктивных ограничений призмы Волластона были впоследствии заменены усовершенствованной системой, предложенной французским ученым Жоржем Номарским (Georges Nomarski). В системе Номарского призмы физически находятся на некотором расстоянии от сопряженных апертурных плоскостей конденсора и объектива. Такая модификация позволила использовать оптические компоненты стандартных микроскопов в современных ДИК-системах, которые в настоящее время находят самое широкое применение.

Аналогично методу фазового контраста, ДИК-микроскопия удобна для визуализации живых клеток и других прозрачных неокрашенных образцов, которые трудно поддаются наблюдению в традиционном светлопольном освещении даже при использовании полной апертуры и максимального разрешения оптической системы микроскопа. При этом ДИК-микроскопия не подвержена таким артефактам, как эффект гало и маскированию апертур, присущих фазово-контрастной оптике, и позволяет получать изображения превосходного качества сравнительно толстых образцов. Кроме того, контраст ДИК-изображений легко повышается при помощи цифровой видеотехники.

Рис. 2. Происхождение контраста в ДИК-микроскопии

Эффект дифференциально-интерференционного контраста состоит в преобразовании разности оптических путей в образце в разность амплитуд (интенсивностей, как показано на рисунке 2), которую можно наблюдать в виде изображения повышенной контрастности в окулярах микроскопа (либо регистрировать на пленке или цифровым способом). Главными определяющими факторами длины оптического пути в образце является разность показателей преломления образца и окружающей среды, а также геометрическое расстояние, которое проходят расщепленные волновые фронты между двумя точками оптического пути. Изображения, полученные при помощи ДИК-системы, имеют «оттененный» вид и выглядят псевдо-трехмерными, как если бы они были получены при освещении светом одного направления, сильно отличающегося от перпендикулярного. В общем случае, метод ДИК удобен для определения ориентации фазовых градиентов и использования полной апертуры объектива, с целью получения тонких оптических срезов образца, свободных от затемнений, создаваемых элементами, расположенными за промежуточной фокальной плоскостью.

Призмы Волластона и Номарского

Основными элементами дифференциально-интерференционной микроскопии являются согласованные двоякопреломляющие призмы Волластона и/или Номарского. Эти призмы устанавливаются в оптический путь микроскопа так, что их оси расщепления ориентированы под углом 45 градусов (с северо-запада на юго-восток) к поляризатору или анализатору. Призма Волластона состоит из двух прецизионно-отшлифованных и отполированных клиновидных кварцевых пластинок с перпендикулярно ориентированными оптическими осями, склеенных по гипотенузам и образующих оптически-анизотропную составную пластинку. Входящие в призму Волластона фронты падающих линейно-поляризованных волн (ориентированных под углом 45 градусов оптическим осям призмы) разделяются на две ортогональные волны, называемые обыкновенной и необыкновенной.

Поскольку падающие фронты исходят из локализованных участков одного источника (обычно, вольфрамовой нити накаливания галогенной лампы), ортогональные волны, формируемые призмой Волластона, когерентны, имеют одинаковую амплитуду и распространяются в одном направлении через нижнюю клиновидную призму (см. рисунок 3(a)). Обыкновенная волна проходит через призму в направлении, перпендикулярном оптической оси, тогда как необыкновенная волна ориентирована параллельно этой оси. Кроме того, различие в диэлектрических параметрах вдоль этих перпендикулярных осей приводит к тому, что одна из волн проходит через призму с более высокой скоростью, нежели другая. Обыкновенная волна проходит через призму вдоль «быстрой» оси (с меньшим показателем преломления), а необыкновенная — вдоль «медленной» оси (с более высоким показателем преломления).

Рис. 3. Призмы Волластона и Номарского для ДИК-микроскопии

При изменении показателя преломления (в месте склейки кварцевых клиньев) происходит угловое расщепление или сдвиг волновых фронтов, в результате которого волны пространственно разделяются на угол, называемый углом сдвига. Кроме того, на границе клиновидной призмы волновые фронты изменяются — обыкновенная волна становится необыкновенной, и наоборот. В призме угол сдвига и величина пространственного расщепления одинаковы для всех падающих волновых фронтов, независимо от точки входа, а направление сдвига волнового фронта определяется осью сдвига призмы. Эта ось лежит в продольной плоскости призмы Волластона и параллельна направлению оптической оси нижнего кварцевого клина. В общем случае, призма Волластона (или Номарского) создает сдвиг величиной менее одного микрометра, вследствие чего выходящий из призмы пучок света не имеет видимого расщепления.

В результате разности показателей преломления обыкновенного и необыкновенного волновых фронтов, скорости прохождения этими фронтами верхней и нижней частей призмы Волластона также различны. В том случае, когда геометрические пути через верхнюю и нижнюю половины призмы одинаковы, фазовый сдвиг, испытываемый волновыми фронтами в нижней части призмы, в точности компенсируется в ее верхней половине. Однако, волновые фронты, падающие на призму на расстоянии от ее центра, проходят более длинную часть пути либо через верхнюю, либо через нижнюю половину призмы, в результате чего испытывают постоянный фазовый сдвиг на единицу длины в направлении оси сдвига. Фазовый сдвиг для обыкновенного и необыкновенного волновых фронтов одинаков по величине, но противоположен по направлению. В результате, на одном конце призмы необыкновенный волновой фронт выходит впереди обыкновенного, а в соответствующей точке на другом конце призмы обыкновенный волновой фронт выходит перед необыкновенным. Фокальная, или интерференционная плоскость призмы Волластона проходит по центру призмы, где оптические пути через верхний и нижний кварцевые клинья равны. По этой причине, зачастую трудно (или даже невозможно) использовать призму Волластона со стандартными объективами микроскопов, задняя фокальная плоскость которых (она должна физически совпадать с интерференционной плоскостью призмы Волластона) оказывается расположенной глубоко внутри линзы.

Подобно традиционной призме Волластона, базовая конструкция призмы Номарского (рисунок 3(b)) также состоит из двух кварцевых клиньев, склеенных по гипотенузам. Верхний клин идентичен верхнему клину призмы Волластона, однако нижний клин призмы Номарского вырезан из кварцевого кристалла таким образом, что его оптическая ось направлена под непрямым углом к плоской грани призмы. Когда клинья соединяются в двоякопреломляющую призму, ее фокальная (интерференционная) плоскость оказывается в нескольких миллиметрах вне пластинки призмы. Этот эффект обусловлен сдвигом, который имеет место на границе раздела «кварц-воздух» в нижнем клине призмы, в отличие от склеенной границы, как в призме Волластона. В результате преломления на границе раздела кварцевых клиньев призмы Номарского, расщепленные волновые фронты сходятся в точке пересечения, находящейся вне призмы (рисунок 3(b)). Действительное положение фокальной плоскости призмы Номарского можно регулировать в диапазоне нескольких миллиметров, путем изменения угла наклона оптической оси в нижнем кварцевом клине призмы.

Во избежание проблемы апертурного зазора объектива, в современные ДИК-микроскопы устанавливаются, как правило, призмы Номарского. В действительности, для расщепления и объединения обоих пучков в фокальных плоскостях конденсора и объектива часто используются модифицированные призмы. Несмотря на некоторые пространственные ограничения для призм конденсора, которые часто могут быть точно расположены в апертурной плоскости, в большинстве случаев, по-прежнему используется призма Номарского. Призмы Номарского для конденсоров могут иметь специальную конструкцию, с тем, чтобы формировать интерференционную плоскость гораздо ближе к призме, чем это имеет место у призм, использующихся с объективами. В результате, помимо того, что две призмы Номарского в современном микроскопе устанавливаются в оправы разной конфигурации и размеров, они, зачастую, по-разному вырезаны и, соответственно, не взаимозаменяемы.

Дифференциально-интерференционная оптическая система с компенсатором Сенармона

Традиционная оптическая система дифференциально-интерференционного микроскопа содержит поляризатор, расположенный перед конденсором и анализатор (еще один поляризатор), который устанавливается в оптический путь над объективом, обычно, в промежуточном тубусе, либо в одной оправе с призмой Номарского. Ось плоскости распространения колебаний в поляризаторе располагается в направлении запад-восток, а в анализаторе она перпендикулярна этому направлению (располагается в направлении север-юг). Призма Номарского, установленная в конденсоре, вблизи сопряженной фокальной плоскости апертуры ирисовой диафрагмы, расщепляет выходящий из поляризатора линейно-поляризованный свет на две составляющие. Падающие волновые фронты расщепляются призмой на ортогональные поляризованные составляющие, которые собираются оптической системой конденсора в параллельный пучок, использующийся для освещения образца.

После того, как расщепленные волновые фронты собираются и фокусируются объективом, они объединяются в сопряженной плоскости задней апертуры при помощи второй призмы Номарского (которая, обычно, устанавливается в регулируемой подвижной оправе). Составляющие объединенных волновых фронтов с круговой и эллиптической поляризацией проходят через анализатор и, затем, интерферируют, создавая ДИК-изображение в промежуточной плоскости изображения микроскопа.

Рис. 4. Влияние компенсатора Сенармона на волновые фронты

В идеально отъюстированном ДИК-микроскопе изображение призмы конденсора отображается конденсором и объективом на призму объектива таким образом, что сдвиг волнового фронта совпадает в каждой точке поверхности призм, инвертированных друг другу. Перемещение любой из призм вдоль оси сдвига, (перпендикулярной к оптической оси микроскопа), приводит к несовпадению волнового фронта, равномерному по всей апертуре микроскопа. Смещение фазового сдвига обыкновенного волнового фронта относительно необыкновенного, вызываемое перемещением призмы, часто называют введением волнового сдвига в ДИК-микроскопии. По мере бокового смещения одной из призм Номарского (обычно, призмы объектива), происходит фазовый сдвиг пары волновых фронтов, участвующих в формировании фона, и их смещение по фазе относительно друг друга. Таким образом, ориентацию вектора поляризации света, выходящего из расположенной у объектива призмы Номарского, можно изменять от линейной (смещение призмы отсутствует), до различных степеней эллиптической, и даже до круговой.

Введение в оптическую ДИК-систему волнового сдвига вызывает изменение интенсивности (амплитуды) фазовых градиентов в образце, в результате чего формируются ориентационно-зависимые светлые и темные участки, которые накладываются на более светлый фон. Градиенты интенсивности возникают вдоль оси сдвига призм конденсора и объектива и, при наблюдении образца через окуляры микроскопа, выглядят, обычно, проходящими под углом 45 градусов (с северо-запада на юго-восток, и наоборот). Смещение призмы в одном или в другом направлении поперек оптической оси микроскопа изменяет соотношение фаз ортогональных волновых фронтов, изменяя ориентацию затененных областей образца на обратную. Конечным результатом является псевдо-трехмерное рельефное изображение образца, на котором области, соответствующие более длинному оптическому пути (наклонному градиенту оптических пучков) выглядят более светлыми или темными, а участки, соответствующие более короткому оптическому пути, выглядят имеющими обратные (противоположные) уровни освещенности.

Растущей популярностью пользуется альтернативный метод введения волнового или фазового сдвига, состоящий в установке (в фиксированной ориентации) между поляризатором и призмой конденсора четвертьволновой фазовой пластинки (компенсатора Сенармона для ДИК-метода). При максимальном ослаблении (используются несмещенные согласованные призмы; см. рисунок 4(b)), «быстрая» ось фазовой пластинки совпадает с осью распространения колебаний в поляризаторе, а оба оптических элемента могут устанавливаться (и часто устанавливаются) в общий корпус в основании микроскопа. В микроскопах, оснащенных соответствующим промежуточным тубусом (см. рисунок 1), компенсатор Сенармона может устанавливаться в альтернативном положении — между призмой объектива и анализатором.

Для введения фазового сдвига при помощи компенсатора Сенармона ось распространения колебаний в поляризаторе поворачивается (до плюс или минус 45 градусов; см. рисунки 4(a) и 4(с)) относительно «быстрой» оси пластинки фазового сдвига, которая остается зафиксированной под углом 90 градусов относительно оси распространения колебаний в поляризаторе. Когда «быстрая» ось компенсатора совпадает (параллельна) с осью распространения колебаний в поляризаторе, через компенсатор Сенармона в призму конденсора проходит только линейно-поляризованный свет (см. рисунок 4(b)). Однако, когда ось распространения колебаний в поляризаторе поворачивается, выходящие из четвертьволновой фазовой пластинки волновые фронты становятся эллиптически- поляризованными. Поворот поляризатора в одном направлении создает пучок света с правосторонней эллиптической поляризацией (рисунок 4(a)), тогда как поворот в противоположном направлении изменяет траекторию вектора поляризации и создает левостороннее эллиптическое вращение (см. рисунок 4(с)).

Рис. 5. Фазовый сдвиг в ДИК-микроскопии с компенсатором Сенармона

Когда ось распространения колебаний в поляризаторе поворачивается на 45 градусов (эквивалент четвертьволнового фазового сдвига), проходящий через компенсатор свет получает круговую поляризацию (с левосторонним или правосторонним поворотом вектора поляризации). Поскольку эллиптическая или круговая поляризация света представляет собой разность фаз между обыкновенным и необыкновенным волновыми фронтами, выходящими из компенсатора Сенармона, сдвиг в системе возникает тогда, когда волновые фронты входят в конденсорную светоделительную призму Номарского и разделяются (см. рисунок 5). Поворот поляризатора в одну сторону создает положительный сдвиг, а в противоположную сторону — отрицательный. Количественно сдвиг, вносимый компенсатором Сенармона, определяется по следующей формуле:

фазовый сдвиг (в нанометрах) = θλ/180,

где θ — угол поворота (в градусах) оси распространения колебаний в поляризаторе относительно «быстрой» оси в фазовой пластине; λ — средняя длина волны света, проходящего через компенсатор. Для вычисления вносимого сдвигового замедления в случае освещения вольфрамово-галогенной лампой, среднюю длину волны часто принимают равной 550 нм. При использовании компенсаторов Сенармона фазовый сдвиг в диапазоне от одной двадцатой до полной длины волны можно легко измерить с точностью 0,15 нанометра.

На рисунке 5 показан эффект фазового сдвига, вносимого в оптическую ДИК-систему компенсатором Сенармона, находящимся в трех различных ориентациях. На всех схемах рисунка 5 представлен одиночный волновой фронт, входящий в центральную часть призмы Волластона, однако, в этом случае призма Номарского работает аналогично. Когда ось распространения колебаний в поляризаторе параллельна «быстрой» оси четвертьволновой фазовой пластинки (рисунки 4(b) и 5(b)), линейно-поляризованный свет выходит из компенсатора и падает на грань нижнего клина конденсорной призмы Волластона (как показано на рисунке 5(b)). В микроскопе, работающем по принципу дифференциально-интерференционного контраста, падающий линейно-поляризованный свет ориентирован под углом 45 градусов к «быстрой» и «медленной» осям нижнего клина призмы Волластона (или Номарского). После входа в призму, поляризованный свет разделяется на ортогональные составляющие, которые проходят по «быстрой» и «медленной» оптическим осям нижнего кварцевого клина, и сдвигаются по фазе относительно друг друга на границе между двумя клиньями призмы. Поскольку линейно-поляризованный фронт при входе в призму представляет собой одну фазу, ортогональные компоненты, образующиеся на границе «воздух-кварц», изначально синфазны, однако внутри призмы они подвергаются фазовому сдвигу.

Как уже упоминалось выше, фазовое приращение обыкновенного волнового фронта в нижней части призмы Волластона становится смещением в верхнем клине призмы, после того, как волновые фронты изменяют ориентацию. В результате происходит ликвидация (компенсация) фазового сдвига, образовавшегося внутри призмы, и ортогональные волновые фронты выходят из призмы Волластона синфазными (рисунок 5(b)). При этом условии оптическая система создает максимальное ослабление, в результате чего видны только большие фазовые градиенты, присутствующие в образце. Эти фазовые градиенты накладываются на очень темный, или черный фон, и приобретают вид темнопольного изображения.

Ситуация полностью изменяется, когда поляризатор в компенсаторе Сенармона поворачивается в одном из направлений относительного нулевого положения. Выходящие из компенсатора волновые фронты имеют фазовый сдвиг, который придает векторной сумме ортогональных волновых составляющих эллиптический или круговой характер. При повороте поляризатора на 30 градусов влево (отрицательный фазовый сдвиг; рисунок 5(a)), создаваемый компенсатором Сенармона обыкновенный волновой фронт входит в призму Волластона раньше необыкновенного волнового фронта, а выходит из призмы (после того, как волновые фронты меняют ориентацию), как необыкновенный волновой фронт, впереди обыкновенного. Основной результат состоит в формировании разности оптических путей, необходимой для внесения фазового сдвига. При повороте поляризатора Сенармона вправо (положительный фазовый сдвиг) возникает противоположный эффект, и обыкновенный волновой фронт выходит из призмы Волластона впереди необыкновенного (рисунок 5(с)).

Конечный результат введения волнового сдвига в дифференциально-интерференционную систему не зависит от способа достижения этого сдвига — перемещения призмы Номарского или поворота поляризатора в компенсаторе Сенармона. В микроскопе соответствующей конфигурации, правильно отъюстированном для освещения по Кёлеру, изображение источника света и конденсорной призмы проецируется оптической системой (конденсором и объективом) на вторую (обратную) призму Номарского, расположенную в задней фокальной плоскости объектива. Линейный сдвиг фазы на всей поверхности призмы конденсора, полностью компенсируется противоположным сдвигом фазы в призме объектива. Перемещение призмы объектива вдоль оси сдвига не влияет на распределение фазового сдвига, но вносит постоянный, положительный или отрицательный, фазовый сдвиг по всей апертуре микроскопа. Аналогично, поворот поляризатора в компенсаторе Сенармона также вносит изменяемый и контролируемый фазовый сдвиг. Система согласованных призм позволяет формировать изображение с одним и тем же волновым сдвигом для каждого из оптических пучков, проецируемых из апертуры конденсора, независимо от пути, по которому тот или иной пучок прошел через образец и достиг объектива.

Рис. 6. Фазовый сдвиг, создаваемый компенсатором Сенармона

На рисунке 6 представлена серия цифровых изображений, полученных по методу дифференциального интерференционного контраста, в диапазоне волнового сдвига от одной двадцатой до четверти волны, с несколькими промежуточными значениями. В качестве образца толщиной 5 микрометров использованы эпителиальные клетки слизистой оболочки щеки человека, помещенные на предметное стекло микроскопа в буферном физиологическом растворе. Изображение получено через покровное стекло толщиной 170 мкм. Клетки образца характеризуются участками с изменяющейся толщиной в диапазоне от 1 до 4 микрометров. Детали образца и теневые псевдо-трехмерные эффекты наиболее отчетливо проявляются при нижних значениях волнового сдвига (рисунки 6(a) и 6(b)); при увеличении сдвига контраст и разрешение тонких деталей образца ухудшаются (рисунки 6(с) — 6(f)). При максимальном сдвиге(четверть волны; рисунок 6(f)) контраст изображения чрезвычайно низка, структурные детали практически не видны. Для рассматриваемого образца оптимальный сдвиг лежит в диапазоне от одной двадцатой до одной двенадцатой длины волны.

В микроскопии по методу ДИК, контрастность изображения возрастает с увеличением градиента (разности) оптических путей. Кроме того, из рисунка 6 видно, что варьирование сдвигового замедления может приводить к значительным флуктуациям контрастности изображения образца в окулярах микроскопа. В общем случае, оптимальное отклонение между обыкновенным и необыкновенным волновыми фронтами, создаваемое перемещением призмы объектива или поворотом поляризатора в компенсаторе Сенармона, меньше одной десятой длины волны. Однако, это значение сильно зависит от толщины образца, — для биологических образцов полезный диапазон значений волнового сдвига составляет от одной тридцатой до четверти длины волны. Хороший контраст изображений образцов с очень большими значениями оптического градиента получается даже при больших значениях волнового сдвига (вплоть до целой длины волны). Введение фазового сдвига в ДИК-микроскопию существенно облегчает наблюдение фазовых образцов и до невероятной степени упрощает получение снимков пленочными или цифровыми камерами

Компенсаторы Сенармона в ДИК-микроскопии

Обычно называемые в полевой или поляризационной микроскопии компенсирующими или волновыми пластинками, компенсаторы можно использовать в ДИК-микроскопии для регулировки контрастности посредством фазового сдвига между обыкновенным и необыкновенным волновыми фронтами. Компенсирующие пластинки обеспечивают более полный контроль регулировки контрастности деталей образца по отношению к интенсивности и цвету фона, а также позволяют более точно настраивать фазовый сдвиг волновых фронтов. Кроме того, эти двоякопреломляющие компоненты часто используются для оптического окрашивания прозрачных образцов, которые при нормальных условиях видны в ограниченном диапазоне оттенков серого цвета.

С целью получения дополнительной количественной информации о разности оптических путей (см. рисунок 7) и создания интерференционной картины Ньютоновских цветовых полос, в микроскопы, оснащенные компенсатором Сенармона для ведения фазового сдвига в дифференциально-контрастную оптическую систему, можно устанавливать компенсирующие пластинки целой длины волны. В оптическую систему ДИК-микроскопа с компенсатором Сенармона волновые пластинки могут устанавливаться между призмой объектива и анализатором, либо между компенсатором и призмой конденсора. Для этой цели в промежуточном тубусе или в блоке конденсора многих микроскопов предусмотрено щелевое гнездо. Установка компенсатора первого порядка (часто называемого полноволновой или красной волновой пластиной первого порядка) со значением сдвига, равным длине волны зеленого диапазона видимого света (приблизительно, 550 нанометров), вносит в образец и в фон интерференционный цветовой спектр (рисунок 7). При установленном компенсаторе зеленый свет не может пройти через анализатор, поскольку он выходит из волновой пластинки линейно-поляризованным, и вектор его электрического поля имеет ту же ориентацию, что и поляризатор. Однако, волновые фронты красной и синей областей спектра испытывают фазовый сдвиг, меньший, чем длина волны, и становятся эллиптически- поляризованными, что позволяет проходить через анализатор. В результате, эти цвета смешиваются и создают в поле зрения пурпурный фон.

Рис. 7. Оптическое окрашивание в ДИК-микроскопии с компенсатором Сенармона и полноволновой пластиной

При наблюдении образца в белом свете (от вольфрамово-галогенной лампы) через дифференциально-интерференционную оптическую систему с компенсатором Сенармона в виде волновой пластинки первого порядка, фон окрашивается в пурпурный цвет, а контраст изображения формируется синим цветом второго порядка и желтым цветом первого порядка (в зависимости от ориентации) Ньютоновских интерференционных полос. При наблюдении через оптическую систему с фазовой пластиной структур с большими градиентами, небольшие изменения сдвигового замедления (в результате поворота поляризатора в компенсаторе Сенармона) приводят к быстрым изменениям интерференционных цветов. Этот метод полезен для внесения цвета (оптическое окрашивание) в области образца, обладающие большим граничным коэффициентом преломления, например, клеточные мембраны, крупные внутриклеточные частицы, жгутики и ядра. Разность оптических путей можно оценить, сравнив интерференционные цвета, создаваемые элементами образца, со значениями цветовой шкалы Майкла-Леви (Michel-Levy color chart).

На рисунке 7 представлены псевдо-трехмерные изображения нескольких полупрозрачных образцов, полученные по стандартной методике сдвигового замедления и методом оптического окрашивания, с четкой демонстрацией различных цветов спектра. Рисунок 7(a) иллюстрирует бороздки на ктеноидной рыбьей чешуе при сдвиговом замедлении, равном, приблизительно, одной двенадцатой длины волны. Установка в оптическую систему микроскопа пластинки-компенсатора первого порядка дает изображение, приведенное на рисунке 7(b). Здесь ктеноидная чешуя имеет интерференционную окраску синим цветом второго порядка и желтым цветом первого порядка, на пурпурном фоне. Аналогичным образом, изображение гидроидного полипа Obelia выявляет большое количество структурных деталей при малых и промежуточных значениях сдвигового замедления (рисунок 7(с)), а с фазовой пластиной в оптической системе дает богатый цветовой спектр (рисунок 7(d)). Кроме того, оптическое окрашивание может оказаться полезным для получения обращенной окраски теневых эффектов, что иллюстрируется изображением прозрачного толстого среза почечной ткани мыши (см. рисунки 7(e) и 7(f)). Хотя представленные на рисунке 7 изображения и не выявляют скрытой научной информации в отношении представленных образцов, они дают возможность методу дифференциально-контрастной оптической микроскопии стать узаконенным мостиком между наукой и искусством.

Интерпретация изображений, полученных по методу ДИК с использованием компенсатора Сенармона

При наблюдении ориентации и распределения теней, имеющихся практически на всех изображениях, полученных с использованием компенсатора Сенармона, направление оптического сдвига становится очевидным, и может быть точно определено, как ось, соединяющая области с наибольшими и наименьшими значениями интенсивности. Уровень контрастности, создаваемый фазовыми градиентами образца, (и степень псевдо-трехмерности) за счет дифференциально-интерференционного контраста по Сенармону, является функцией величины сдвига, вносимого в оптическую систему поворотом поляризатора в компенсаторе. Поскольку ось сдвига неподвижна (вследствие конструкции призмы Номарского и других ограничений, связанных с ориентацией волнового фронта в ДИК-микроскопии), воздействие на контраст образца путем простой настройки микроскопа (изменения направления оси) невозможно. Однако, повернув поляризатор в компенсаторе Сенармона на соответствующий отрицательный угол, относительное запаздывание по фазе между обыкновенным и необыкновенным волновыми фронтами можно изменить на противоположное. В случае такого изменения фазового запаздывания ориентация границ светлых и темных участков на изображении образца изменяется на 180 градусов. В сущности, микроскописту доступен единственный способ изменения ориентации оси сдвига относительно образца, — изменение ориентации самого образца. Этот маневр обеспечивается за счет использования круглых предметных столиков, поворачиваемых на 360.

Для каждого образца, исследуемого по методу сенармоновской ДИК-микроскопии, существует оптимальная настройка (компенсатором Сенармона) сдвигового запаздывания, создающего максимальный уровень контрастности конечного изображения. Для очень тонких образцов с малым показателем преломления, например, живых клеток в культуре, оптимальными, как правило, являются малые значения сдвига (небольшие смещения поляризатора), ненамного превышающие максимальный фазовый сдвиг, существующий в образце (порядка одной двенадцатой длины волны, или 30 нм). Однако, чтобы получить удовлетворительные результаты для более толстых образцов, часто требуются более значительные задержки (до четверти длины волны) при больших апертурах конденсора и, как правило, путем получения оптического среза. Поскольку многие образцы состоят из компонентов различных размеров с разными показателями преломления, оптимальная настройка компенсатора Сенармона (значение сдвига), как правило, является компромиссом.

Получение оптических срезов в сенармоновской ДИК-микроскопии

Возможность сенармоновской ДИК-микроскопии создавать изображение образца при больших числовых апертурах конденсора и объектива позволяет получать необыкновенно тонкие оптические срезы в плоскости сфокусированного изображения. Свободный от мешающих гало и отвлекающих флуктуаций интенсивности (создаваемых яркими участками) в находящихся вне фокальной точки латеральных плоскостях, этот метод дает четкие изображения, являющиеся аккуратными срезами сложного трехмерного фазового образца. Это свойство часто используется для получения четких оптических срезов клеточных контуров сложных тканей, при минимальных помехах от структур, находящихся выше и ниже фокальной плоскости.

Во всех традиционных видах оптической микроскопии, выполняемой в проходящем и в отраженном свете, главную роль в определении контрастности и разрешения играет апертурная ирисовая диафрагма конденсора. Уменьшение размера апертуры повышает глубину поля и общую резкость изображения, одновременно улучшая его контраст. Однако, при слишком малых отверстиях диафрагмы становятся заметными дифракционные искажения, и ухудшается разрешение. Зачастую, оптимальная настройка апертурной диафрагмы представляет собой компромисс между возможностью точного отображения деталей образца с достаточной контрастностью и сохранением разрешения, необходимого для отображения мельчайших особенностей образца без дифракционных искажений.

95.1.jpg

Рис. 8. Получение оптических срезов в сенармоновской ДИК-микроскопии

Большинство высококачественных оптических ДИК-систем с компенсатором Сенармона создают превосходный контраст, когда значение ирисовой диафрагмы конденсора составляет, приблизительно, 70 процентов от размера задней апертуры объектива. Однако, микроскопы с такими оптическими системами превосходно работают и тогда, когда значение диафрагмы конденсора равно диаметру задней апертуры объектива. Для достижения оптимального баланса между разрешением и контрастом, в экспериментах по получению оптических срезов очень важно, чтобы конфигурация микроскопа соответствовала освещению по Келеру, а компоненты призмы Номарского, анализатора и компенсатора Сенармона были точно отъюстированы.

На рисунке 8 представлены оптические срезы, полученные на колонии Volvox при исследованиях по методу дифференциально-интерференционного контраста с компенсатором Сенармона культуры тканей в инвертированном микроскопе. Водные микроорганизмы содержат от нескольких сотен до нескольких тысяч идентичных клеток зеленых водорослей, приблизительно, одного диаметра, но организованы в виде нескольких морфологических фрагментов. На периферии колонии отдельные клетки расположены в виде полупрозрачного, широкого слоя, называемого клейким (см. рисунок 8(a)). В глубине массива колония образует несколько концентрических сферических групп репродуктивных клеток, имеющих название гонидии, которые, в свою очередь, образуют небольшие дочерние колонии в пределах родительской колонии (рисунок 8(b)). При фокусировке микроскопа на самом верхнем слое клейких клеток колонии (рисунок 8©), становятся видны структурные детали отдельных клеток, однако многие клетки маскируются дочерней колонией.

Тонкие биологические образцы (толщиной 10 — 20 мкм) дают, как правило, плохие оптические срезы при низких уровнях увеличения, однако, при наблюдении через объективы с большим увеличением и большой числовой апертурой (60x и 100x), часто выявляют важные внутренние детали. Оптические срезы более толстых образцов легко получаются при малых увеличениях, создающих минимальные аберрации. Получению оптических срезов с более толстых биологических образцов, в особенности, погруженных в водный солевой раствор или в буферные растворы, зачастую мешает сферическая аберрация, обусловленная скачкообразным изменением показателя преломления на границе раздела между покровным стеклом и заливочной средой. По мере увеличения глубины проникновения, при получении серии оптических срезов, эта аберрация снижает разрешение.

Заключение

В микроскопии по методу дифференциально-интерференционного контраста разность фаз возникает за счет разности геометрических длин путей и различий в показателях преломления образца для двух ортогональных волновых фронтов, формируемых помещенной в конденсор призмой Номарского. В результате происходит эллиптическая поляризация волновых фронтов, которые воссоединяются призмой Номарского, и последующее формирование изображения прошедшими через анализатор составляющими волновых фронтов. Фазовый сдвиг в оптической системе можно получить путем перемещения призмы объектива вдоль оптической оси микроскопа, либо сочетанием четвертьволновой пластинки с поляризатором или анализатором (компенсатор Сенармона). Таким образом, оптимальный контраст, яркость поля и чувствительность могут быть достигнуты простым поворотом рукоятки регулировки. Использование в ДИК-микроскопии компенсатора Сенармона дает некоторые преимущества, в сравнении с традиционными конструкциями, основанными на перемещении призмы Номарского. Эти преимущества, отчасти, определяют растущую популярность метода Сенармона.

Для большинства ДИК-микроскопов, в которых используется перемещение призмы Номарского в задней фокальной плоскости объектива, трудно точно определить количественный фазовый сдвиг, создаваемый в оптической системе. В некоторых случаях используются призмы Номарского, установленные в оправы с прецизионными микрометрическими механизмами перемещения. Эти механизмы можно использовать для точного измерения сдвига, создаваемого перемещением призмы, с небольшим шагом. Однако, любой ДИК-микроскоп можно модернизировать для точного измерения сдвига при помощи компенсатора Сенармона. Для этого достаточно добавить в оптическую систему микроскопа поворотный поляризатор или анализатор с измерительной шкалой и неподвижную четвертьволновую замедляющую пластинку.

Одна из конструкций микроскопов, наиболее удобная для количественного определения сдвига, представлена на рисунке 1. В основном корпусе такого микроскопа, между призмой Номарского в револьвердержателе объективов и окулярными тубусами, установлен промежуточный тубус. В промежуточном тубусе установлен стандартный (на длину волны 550 нанометров) компенсатор Сенармона (изначально предназначенный для измерений в поляризованном свете). Компенсатор смонтирован в неподвижной оправе так, что его «быстрая» ось расположена параллельно поляризатору (восток-запад), а «медленная» — параллельно анализатору (север-юг). Над компенсатором Сенармона находится оправа с линейным поляризатором (работающим, как анализатор), поворачиваемая на 360 градусов, на которую нанесена шкала (в градусах). Рукоятка настройки кругового перемещения, часто оснащаемая микрометрическим нониусом, позволяет точно определять ориентацию оси распространения колебаний в линейном поляризаторе, и дает возможность контролировать (и измерять) значение сдвига с точностью до нескольких долей длины волны. Модифицировав ДИК-микроскоп, изначально предназначенный для создания сдвигового замедления путем перемещения призмы Номарского, до описанной выше конструкции, можно точно определять фазовый сдвиг. Однако, при этом важно сначала настроить согласованные призмы (для объектива и конденсора) на максимальное перекрытие интерференционных полос (максимальное ослабление), и только после этого устанавливать компенсатор Сенармона и поворотный анализатор.

Еще одно преимущество конструкции Сенармона состоит в близости компонентов компенсатора к важным сопряженным плоскостям формирования изображения и апертуры в оптической системе микроскопа. В микроскопах с подвижной призмой Номарского необходимо физически перемещать составную призму поперек оптического пути, а микроскопист в это время должен контролировать величину вносимого в систему сдвигового замедления. Во многих случаях, во время перемещения призмы, в особенности при неплотной посадке ее оправы, возможны серьезные смещения изображения. Такие смещения препятствуют наблюдению образца и проведению съемки. В процессе создания сдвигового замедления в ДИК-микроскопе с компенсатором Сенармона смещение изображения отсутствует, главным образом, потому, что фазовая пластинка компенсатора и поворотный поляризатор расположены перед конденсором или за объективом, т. е., в осветительном пути микроскопа, а не среди формирующих изображение оптических элементов. При выборе конструкции микроскопа для проведения количественных экспериментов по методу дифференциально-интерференционного контраста, это отличие следует рассматривать, как главный фактор.

При сравнении микроскопов традиционной и сенармоновской конструкций важно учитывать, также, и эргономические аспекты. Рукоятки фокусировки и управления предметным столиком современных микроскопов расположены в передней части основания микроскопа и легко доступны оператору. Эти особенности обеспечивают более свободную и комфортную позу оператора, при которой руки удобно опираются на стол, что снижает утомление и вероятность возникновения стресса, который, в конечном итоге, может привести к нейромышечным нарушениям. Работая с традиционным ДИК-микроскопом, оператор вынужден постоянно поднимать руку (и плечо) выше объектива, чтобы отрегулировать положение призмы Номарского. В эргономичной сенармоновской конструкции компенсатор установлен на основании микроскопа, над отверстием осветителя, рядом с низко расположенными рукоятками фокусировки и управления перемещением предметного столика. Непосредственная близость друг к другу всех механизмов управления ДИК-микроскопом такой конструкции кардинальным образом снижает утомление оператора во время длительного непрерывного наблюдения.

Современные методы видеомикроскопии обладают тем преимуществом, что дают возможность точно измерять значения сдвигового замедления, создаваемого компенсаторами Сенармона. Один из таких методов, часто обозначаемый сокращением VE-DIC (видео дифференциально-интерференционный контраст), позволяет регистрировать такие тонкие структурные детали образца, которые остаются вне пределов оптического разрешения составных микроскопов. Видео-модернизированнаяДИК-микроскопия является мощным инструментом для проведения исследований в области клеточной биологии, где она позволяет измерять совокупную динамику отдельных микротрубок и визуализировать движение ресничек бактерий — с использованием иных методик то и другое, попросту, невозможно. Как уже упоминалось, большинство очень тонких ДИК-образцов лучше всего наблюдать при среднем значении сдвигового замедления в одну двадцатую длины волны. Однако, при использовании метода видео-дифференциально-интерференционного контраста для получения изображений образцов, требующих суб-разрешения (например, микротрубок или миниатюрных органелл), требуются волновые сдвиги, приблизительно, в одну сотую длины волны. Очевидно, что такие малые уровни замедления лучше всего достигаются при помощи компенсатора Сенармона, оснащенного прецизионным поворотным поляризатором (или анализатором) с нониусом и измерительной шкалой.

Говоря об основных преимуществах получения изображений с использованием микроскопии по методу дифференциально-интерференционного контраста, независимо от механизма создания волнового сдвига, следует отметить, что (в отличие от методов темнопольного или фазового контраста) мелкие детали образца не затемняются прилегающими к ним участками, имеющими более значительные градиенты оптических путей. Вдобавок, оттененное изображение на нейтральном сером фоне, в совокупности с чувствительностью в отношении как очень мелких, так и значительно более крупных деталей, (например, мельчайших придатков живых клеток или динамических включений и подвижных органелл в клетке), представляет собой существенное усовершенствование традиционных приемов улучшения контрастности. Упомянутые преимущества, в дополнение к широкому динамическому диапазону регулировки контрастности и малой глубине поля, способствуют росту популярности описываемого метода.

Почему стоит работать с нами?

Комплексные поставки медицинского оборудования и мед. изделий
Прямые контракты с производителями - поставки оборудования на оптимальных условиях
Устойчивое финансовое положение позволяет участвовать в торгах любого объема
Широкая номенклатура товаров - более 3000 наименований товара на складе
Спонсорская поддержка наших партнеров и агентов
Богатый международный опыт поставок - торговые представительства в 50 странах мира

Связь со специалистом

Запросить цену

Заказать сервис

Отправить резюме

Подписаться на рассылку

Запросить коммерческое предложение