Метод дифференциально-интерференционного контраста (III)

ДИК-Микроскопия отраженного света

В сравнении с типовой конфигурацией, использующейся для микроскопии проходящего света, основные параметры устройств для дифференциально-интерференционного контраста (ДИК) в отраженном свете намного проще. Главным образом, это обусловлено необходимостью использования только одной двоякопреломляющей призмы Номарского или Волластона, а также тем, что один объектив работает и как конденсор и как система формирования изображения. Благодаря двойному назначению объектива микроскопа, интерференционная картина, создаваемая призмой Номарского и проецируемая на заднюю фокальную плоскость объектива, одновременно находится в фокальной плоскости осветительной оптической системы конденсора.

Рис. 1. Оптическая система ДИК-микроскопа отраженного света

Микроскопия в отраженном свете является одним из самых распространенных методов исследования непрозрачных образцов, обладающих, как правило, высокой отражательной способностью, благодаря чему они не поглощают и не пропускают сколь-нибудь значительные количества падающего на них света. Выступы, впадины и другие неоднородности поверхности образца создают разности оптических путей. Эти разности преобразуются микроскопом, работающим по принципу дифференциально-интерференционного контраста в отраженном свете, в изменения амплитуды или интенсивности, проявляющиеся в виде топографического профиля. В отличие от случая с проходящим светом и полупрозрачными фазовыми образцами, изображение, создаваемое по методу дифференциально-интерференционного контраста в отраженном свете, часто можно интерпретировать, как действительно трехмерное представление рельефа поверхности, обеспечивающее четкое различие между выступами и впадинами образца.

На рисунке 1 в разрезе схематично представлены основные элементы оптической системы микроскопа, работающего по методу дифференциально-интерференционного контраста в отраженном свете. Свет от источника освещения проходит через апертурную и полевую диафрагмы (не показаны) вертикального (эпископического) осветителя и попадает на линейный поляризатор, ось распространения колебаний в котором ориентирована в направлении «восток-запад» относительно штатива микроскопа. Выходящий из поляризатора линейно-поляризованный свет отражается от поверхности полупрозрачного зеркала, установленного под углом 45 градусов к падающему пучку. Отклоненные световые волны, проходящие теперь вдоль оптической оси микроскопа, попадают в призму Номарского, расположенную над объективом в револьверном держателе микроскопа. Здесь они разделяются на ортогональные поляризованные составляющие, которые сдвигаются относительно друг друга на расстояние, определяемое геометрией двоякопреломляющей призмы.

Работающий в качестве превосходно отъюстированного и оптически скорректированного осветительного конденсора, обладающий высокой числовой апертурой, объектив микроскопа фокусирует создаваемые призмой Номарского расщепленные ортогональные волновые фронты на поверхность непрозрачного образца. Отраженные волновые фронты проходят по оптическим путям разной длины, определяемым топографией образца, собираются и фокусируются объективом в интерференционной плоскости призмы Номарского, где они воссоединяются, и сдвиг между ними ликвидируется. Выйдя из призмы Номарского, волновые фронты проходят по прямой траектории через полупрозрачное зеркало и попадают в анализатор (второй поляризатор), ось распространения колебаний в котором ориентирована в направлении «север-юг». Составляющие ортогональных волновых фронтов, параллельные вектору распространения колебаний в анализаторе, проходят через анализатор в общем азимутальном направлении и, затем, интерферируют в плоскости нерегулируемой диафрагмы окуляра, создавая амплитудные флуктуации и формируя ДИК-изображение. В микроскопии по методу дифференциально-интерференционного контраста изображение формируется в результате интерференции двух различных волновых фронтов, достигающих плоскости изображения с некоторым относительным сдвигом по фазе. Таким образом, получающееся изображение не является простой алгебраической суммой интенсивностей света, отраженного в направлении плоскости изображения, как это имеет место в случае других методов получения изображений.

Основное различие методов дифференциально-интерференционного контраста в проходящем и в отраженном свете состоит в том, что в первом случае для разделения и воссоединения пучка света требуются две призмы Номарского (или Волластона), тогда как для метода отраженного света нужна только одна такая призма. В ДИК-микроскопии в отраженном свете, свет дважды проходит через одну и ту же призму Номарского в противоположных направлениях. Сдвиг, возникающий при прохождении света через призму в направлении к объективу, аннулируется во время второго прохождения света через эту же призму, после отражения от поверхности образца. В этом отношении, призма Номарского и объектив выполняют для входящих световых волн ту же функцию, что и первая призма и конденсор оптической системы микроскопа, работающего в проходящем свете. Аналогичным образом, свет, отраженный от поверхности образца, собирается и фокусируется объективом в интерференционной плоскости призмы Номарского (сопряженной с задней фокальной плоскостью объектива), подобно тому, как это происходит в проходящем свете.

На рисунках 2(a) и 2(b) показаны оптические пути, соответственно, всего волнового фронта и одиночного, отклоненного от оси светового луча, в ДИК-микроскопии отраженного света. Во всех случаях, линейно-поляризованный свет из поляризатора отклоняется полупрозрачным зеркалом и поступает в расположенную за объективом призму Номарского. Расщепленные волновые фронты фокусируются объективом, попадают на образец и затем отражаются (возвращаются) в переднюю линзу объектива в виде искаженных волновых фронтов (рисунок 2(a)) или распределения градиента непрозрачности (рисунок 2(b)). Благодаря разности оптических путей, по которым проходят два ортогональных волновых фронта, часть воссоединенного светового потока проходит через анализатор и формирует ДИК-изображение. Из рисунка 2(b) видно, что траектория падающего на образец светового луча отклоняется от оптической оси микроскопа на такое же расстояние, что и траектория луча, отраженного от поверхности образца.

Призмы Волластона и Номарского для микроскопии по методу дифференциально-интерференционного контраста в отраженном свете изготавливаются тем же способом, что и для микроскопов, работающих в проходящем свете. Одиночная двоякопреломляющая призма состоит из двух прецизионно отшлифованных и отполированных клинообразных кварцевых пластин, одинаковых по форме, но с различной ориентацией оптических осей. В призме Волластона кварцевые клинья склеены по гипотенузам так, что их оптические оси перпендикулярны друг другу. В призме Номарского ось одного из клиньев параллельна плоской грани призмы, тогда как ось второго клина имеет наклонную ориентацию. Вследствие геометрических ограничений, интерференционная плоскость призмы Волластона располагается вблизи центра соединения кварцевых клиньев (внутри тела призмы). Интерференционная же плоскость призмы Номарского располагается на удалении в пространстве (вне тела призмы). Попадающие в призму Волластона или Номарского, падающие линейно поляризованные световые волны (параллельные оптической оси микроскопа), разделяются на две взаимно перпендикулярные (ортогональные) составляющие. Эти составляющие называются обыкновенной и необыкновенной волнами, имеют одинаковые амплитуды (70,7% исходной поляризованной волны) и когерентны (естественно, при условии, что источник освещения также когерентен). С целью получения ортогональных составляющих одинаковой амплитуды, направление колебаний вектора электрического поля линейно-поляризованного света, поступающего в призму Номарского или призму Волластона, должно составлять угол в 45 градусов относительно главной оптической оси верхнего клина призмы.

Рис. 2. Оптический путь в ДИК-микроскопе отраженного света

В месте склейки кварцевых клиньев призмы Волластона происходит угловое расщепление или сдвиг ортогональных волновых фронтов, в результате которого волны пространственно разделяются на некоторый угол, называемый углом сдвига. Кроме того, на границе раздела клиньев обыкновенная и необыкновенная волны меняют ориентацию и расходятся (удаляются друг от друга). Степень расхождения зависит от показателя преломления среды (кварцевой призмы), через которую проходит каждая из волн. Угол сдвига и величина пространственного разделения одинаковы для всех волновых фронтов, падающих на поверхность призмы, независимо от точки входа. Направление сдвига волнового фронта определяется осью сдвига призмы. Эта ось лежит в плоскости призмы Волластона и параллельна направлению оптической оси нижнего кварцевого клина. В призме Номарского сдвиг волнового фронта (на границе раздела «кварц-воздух») создается клином с наклонной оптической осью, этот же клин отвечает за направление оси сдвига.

Призмы Номарского и Волластона не только разделяют линейно-поляризованный свет на две ортогональные составляющие, но и создают для каждого из волновых фронтов фазовый сдвиг (часто называемый разностью оптических путей) относительный другого (иными словами, относительный фазовый сдвиг). Величина относительного фазового сдвига волновых фронтов линейно зависит от места входа пучка света относительно направления сдвига. Следовательно, разность оптических путей для ортогональных составляющих световой волны можно регулировать поперечным перемещением призмы вдоль оптической оси микроскопа в направлении сдвига (процесс, известный под названием «внесение сдвигового замедления»). Таким образом, для создания характерного оттененного внешнего вида (с помощью хорошо известной ДИК-микроскопии), можно использовать метод манипулирования тонкой настройкой относительной интенсивности в области изображения. Изображения выглядят так, как если бы они были получены при освещении светом, исходящим из одного азимутального направления, сильно отличающегося от перпендикулярного.

Поскольку интерференционная плоскость традиционной призмы Волластона располагается посередине призмы (приблизительно, на средней линии между двумя кварцевыми клиньями), такую призму сложно приспособить для использования со стандартными объективами микроскопов, работающих в отраженном свете по методу дифференциально-интерференционного контраста. Проблема обусловлена тем, что интерференционная плоскость призмы должна совпадать и перекрываться с задней фокальной плоскостью объектива, которая часто располагается ниже резьбового крепления, внутри стеклянной линзы. С другой стороны, внешнее расположение интерференционной плоскости призмы Номарского делает ее идеальной для использования с объективами микроскопов. Такая призма может располагаться на некотором расстоянии от объектива (например, в револьверном держателе), обеспечивая, при этом, сопряжение задней фокальной плоскости объектива с интерференционной плоскостью составной призмы. В ДИК-микроскопе, работающем в отраженном свете, призма Номарского ориентирована так, что ее интерференционная плоскость перпендикулярна оптической оси микроскопа (равно, как и совпадающая с ней задняя фокальная плоскость объектива).

Обыкновенный и необыкновенный волновые фронты проходят к образцу через призму Номарского по оптическим путям разной длины. Разность длин оптических путей зависит от места входа волнового фронта в призму. Выйдя из призмы, волновые фронты попадают в объектив (работающий, как конденсор осветителя) с задней стороны, собираются в параллельный пучок и проецируются на образец. Отраженные от горизонтального непрозрачного образца, ортогональные волновые фронты возвращаются в объектив, но уже с противоположной (передней) стороны и на том же расстоянии от оптической оси (см. рисунок 2(b)). Волновые фронты собираются и фокусируются объективом в интерференционной плоскости призмы Номарского (на стороне, противоположной той, из которой они вышли по пути вниз). Возникающий при этом фазовый сдвиг в точности компенсирует исходную разность, созданную до входа световых волн в объектив. В результате, взаимный обмен местоположениями («перестановка») падающей и отраженной волн аннулирует относительный фазовый сдвиг по всей апертуре микроскопа. Система такого типа называются самокомпенсирующейся, а создаваемое ею изображение имеет однородную интенсивность. Процесс компенсации фазового сдвига в ДИК-системе отраженного света можно сравнить с аналогичным процессом в системе с проходящим светом, где для разделения и воссоединения светового пучка используются две согласованные, но обратные призмы Номарского (или Волластона). В системе с проходящим светом изображение конденсорной призмы (часто называемой компенсирующей призмой) проецируется на призму для объектива (главную призму), в связи с чем, значения разности оптических путей в каждой точке поверхности этих призм одинаковы. Таким образом, в конструкции с проходящим светом главная и компенсирующая призмы разделены, тогда как, в ДИК-микроскопе отраженного света главная призма является, одновременно, и компенсирующей.

Световые пучки для ДИК-микроскопии в отраженном свете должны быть, как минимум, умеренно коллимированными. Это необходимо для обеспечения однородной компенсации по всей ширине пучка, при двух проходах через призму, а также для гарантированной регистрации фазовых сдвигов, создаваемых наклонными участками и границами области отражения в образце. Поскольку разность фаз, возникающая в пучке при первом прохождении через призму, является функцией пути, чтобы получить точную компенсацию сдвига фаз, отраженный пучок должен пройти через дополнительный участок призмы. Чтобы обеспечить должную коллимацию светового пучка и сформировать параллельные (или почти параллельные) оптической оси входные световые волны, микроскоп должен быть надлежащим образом настроен на режим освещения по Кёлеру. Недостаточно коллимированный входной пучок ведет к неоднородной компенсации в призме (и на получаемом изображении) и к нарушению однозначного фазового соотношения ортогональных составляющих в каждой точке изображения.

Конструкция микроскопа отраженного света

Ключевым элементом для всех видов микроскопии в отраженном свете, включая методы светлого и темного поля, поляризованного света, флуоресцентной микроскопии и дифференциально-интерференционного контраста, является вертикальный осветитель. Осветитель отраженного света (часто называемый коаксиальным или осевым) можно устанавливать на большинство серийно выпускаемых универсальных штативов для микроскопов научно-исследовательского уровня. Основная функция вертикального осветителя состоит в формировании полукогерентного и коллимированного светового пучка, направлении его в заднюю апертуру объектива микроскопа и, затем, на поверхность образца. Отраженные световые волны собираются объективом, после чего проходят через оптическую систему, аналогичную оптической системе большинства микроскопов проходящего света. Основным компонентом вертикального осветителя является частично отражающее плоское стеклянное зеркало (называемое полупрозрачным зеркалом; см. рисунок 3). Это зеркало отклоняет свет, идущий из горизонтального осветителя, на 90 градусов, в вертикальную оптическую систему формирования изображения. Кроме того, расположенное под углом 45 градусов к оптическим осям осветителя и микроскопа, полупрозрачное зеркало пропускает выходящий из объектива свет (не отклоняя его) вверх, в окуляры и фотографическую систему.

Современные вертикальные осветители предназначены для различных систем формирования изображений и содержат, как правило, конденсорную систему, позволяющую коллимировать и контролировать световой поток от источника света. Вертикальные осветители оснащаются ирисовой апертурной диафрагмой и предварительно сфокусированной центрируемой полевой диафрагмой, что позволяет использовать микроскоп в режиме освещения по Кёлеру (рисунок 3). Кроме того, в вертикальных осветителях предусмотрены многочисленные щелевые гнезда и отверстия для установки коррекционных и нейтральных фильтров, поляризаторов, компенсаторов и комбинированных флуоресцентных фильтров в оправах кубической формы. В конфигурации для работы с объективами, скорректированными на бесконечность, вертикальный осветитель оснащается тубусной линзой (см. рисунок 1) для фокусировки световых волн в промежуточной плоскости изображения. В вертикальных осветителях могут использоваться как вольфрамово-галогенные, так и дуговые осветители (зачастую, попеременно), с широким диапазоном интенсивности освещения и спектральных характеристик.

Рис. 3. Конструкция вертикального осветителя для микроскопа отраженного света

Наиболее популярным источником света для микроскопии в отраженном свете (включая метод дифференциально-интерференционного контраста) является все та же галогенная лампа накаливания с вольфрамовой нитью, сравнительно дешевая и долговечная. Галогенные лампы накаливания обеспечивают умеренную яркость, но для получения цифровых изображений и традиционной микрофотосъемки на пленку требуют применения коррекционных светофильтров, с целью повышения цветовой температуры до уровней дневного света. Альтернативный вариант, удобный при больших увеличениях и очень малом сдвиговом замедлении (где критична интенсивность освещения), представляет собой ксеноновая дуговая лампа мощность 75 Вт или 150 Вт. Ксеноновые лампы характеризуются высокой яркостью во всем спектре видимого излучения, и создают цветовую температуру, приблизительно соответствующую цветовому балансу дневного света.

При использовании белого света вольфрамово-галогенной или дуговой лампы для ДИК-микроскопии в отраженном свете, связанные с топографическими различиями в образце интерференционные полосы могут выглядеть, как расположенные вдоль структурных деталей узкие радужные узоры, вызванные ослабляющей интерференцией различных цветовых составляющих света на несколько отличающихся друг от друга участках поверхности. Использование в специальных системах освещения с более узким диапазоном длин волн (например, лазерного излучения) создает ДИК-изображение, в котором интерференционные полосы формируются волнами одной длины. Такие полосы имеют большую резкость и определенность, а их местоположение не зависит от спектральной чувствительности фотоприемника.

На рисунке 4 представлены изображения участка поверхности в области контактной площадки интегральной микросхемы, полученные в отраженном свете от вертикального осветителя по методам темного поля, светлого поля и дифференциально-интерференционного контраста. Светлопольное изображение (рисунок 4(a)) страдает значительным отсутствием контрастности компонентов микросхемы, но дает общую картину всех деталей, имеющихся на поверхности. Темнопольное изображение (рисунок 4(b)) дает немногим более деталей, чем светлопольное, но выявляет неоднородности вблизи вертикальной шины (центр правой части изображения), а также кромки контактной площадки слева. Изображение по методу дифференциально-интерференционного контраста (рисунок 4(с)) дает наиболее полную картину структуры поверхности, включая зернистую текстуру поверхности контактной площадки, идущие от нее к шинам соединения и большое количество компонентов микросхемы в левой стороне изображения.

Рис. 4. Изображение интегральной микросхемы в светлом поле, в темном поле и по методу ДИК

Метод освещения по Кёлеру в микроскопе отраженного света основывается на использовании двух регулируемых диафрагм, расположенных в вертикальном осветителе. Конфигурация базовой системы такова, что изображение нити накаливания лампы фокусируется в плоскости апертурной диафрагмы, которая является сопряженной с задней фокальной плоскостью объектива (где также можно наблюдать сфокусированную нить накаливания). Использующаяся для задания ширины осветительного пучка, полевая диафрагма расположена в одной сопряженной плоскости с образцом и нерегулируемой диафрагмой окуляра. Апертурная ирисовая диафрагма расположена ближе к источнику света, а полевая диафрагма — ближе к объективу (конфигурация, обратная использующейся для проходящего света). Метод дифференциально-интерференционного контраста особенно чувствителен к освещению по Кёлеру, поскольку для создания высокой контрастности, проходящие через призму Номарского световые волны должны быть коллимированы и равномерно диспергированы по всей апертуре микроскопа.

В большинстве микроскопов отраженного света полевую диафрагму можно центрировать в оптическом пути, частично закрыв ирисовую апертуру и перемещая саму диафрагму при помощи набора центрирующих винтов (или рукояток), расположенных рядом с рычагом регулировки отверстия диафрагмы. На практике, полевую диафрагму следует открывать только до тех пор, пока она не выйдет за пределы поля зрения или области съемки пленочной либо цифровой камерой. Основное назначение полевой диафрагмы состоит в регулировке размера поля зрения и защите от паразитных засветок, искажающих детализацию изображения образца. Сочетание полевой и апертурной диафрагм определяет геометрию конуса света и, следовательно, угол падения света на образец со всех азимутальных направлений. Для регулировки контрастности образца, размер ирисовой диафрагмы можно изменять. В общем случае, ее апертура должна составлять 60% — 80% от задней апертуры объектива. Такая настройка обеспечивает наилучший компромисс между разрешением и контрастом.

Конфигурация ДИК микроскопа отраженного света

Поскольку компоненты для метода дифференциально-интерференционного контраста должны быть прецизионно согласованы с оптической системой, модернизация существующего микроскопа отраженного света, который изначально не был предназначен для работы по методу дифференциально-интерференционного контраста, представляет собой нежелательный подход. И действительно, производители микроскопов сегодня предлагают промышленные и научно-исследовательские микроскопы, оснащенные вертикальными осветителями, а также оптические компоненты (обычно, продающиеся в виде комплектов), необходимые для оснащения микроскопа для работы по методу дифференциально-интерференционного контраста. Несколько различных подходов к конструкции прибора предоставляют два альтернативных варианта внесения сдвигового замедления в оптическую систему микроскопа для дифференциально-интерференционного контраста.

Традиционный способ реализации режима дифференциально-интерференционного контраста в отраженном свете состоит в использовании призмы Номарского, закрепленной на подвижной каретке в прямоугольной оправе (часто называемой ползунком), которая устанавливается в основание револьверного держателя микроскопа, над револьвером объективов (рисунки 5(a) и 5(b)). В такой конструкции фазовый сдвиг создается поворотом дискового регулятора, расположенного в торце ползунка, который, в свою очередь, перемещает призму Номарского вперед-назад поперек оптической оси микроскопа. В альтернативной методике, называемой компенсацией Сенармона (см. рисунок 6), для каждого объектива используется отдельная неподвижная призма (рисунок 5(d)), а также четвертьволновая пластинка в сочетании с линейным поляризатором (рисунок 5(с)). При помощи этих компонентов создается разность оптических путей (фазовый сдвиг) ортогональных волновых фронтов.

Рис. 5. Оптические компоненты ДИК-микроскопа отраженного света

Все конструкции микроскопов для наблюдений в отраженном свете, в которых используется вертикальный осветитель, страдают от рассеянного или паразитного света, создаваемого отражениями света от осветителя на поверхностях элементов оптической системы. В частности, плоские поверхности (верхняя и нижняя) призмы Номарского могут создавать такие отражения, вызывающие чрезмерный блеск и ухудшающие качество изображения. Для противодействия этому явлению, призмы Номарского для микроскопии в отраженном свете изготавливаются так, чтобы их интерференционная плоскость располагалась под углом к оси сдвига призмы (см. рисунок 2(b)). Когда интерференционная плоскость специальной призмы Номарского совмещается (путем регулировки ее положения в скользящей оправе или в неподвижном корпусе) с задней фокальной плоскостью объектива, перпендикулярной оптической оси микроскопа, плоские внешние поверхности клиньев оказываются наклоненными относительно аксиального пути осветительного луча (рисунки 1, 2(b) и 5(a)). В результате, отражения отклоняются от полупрозрачного зеркала, образца, окуляров и системы регистрации изображений, и не оказывают отрицательного влияния на интенсивность и контраст изображения.

В современных микроскопах расстояние между фокальной плоскостью объектива и установочной поверхностью револьверного держателя является постоянной величиной, и часто называется парфокальным расстоянием. Таким образом, во многих случаях для разделения и воссоединения светового пучка во всем диапазоне коэффициентов увеличения можно использовать одиночную призму Номарского, которая устанавливается в скользящей оправе в револьверном держателе, на фиксированном расстоянии от места установки объективов (и, соответственно, их задних фокальных областей). В некоторых случаях, особенно при больших увеличениях, изменение положений задней фокальной плоскости объектива можно компенсировать осевым перемещением призмы Номарского в пределах скользящей оправы (см. рисунки 5(a) и 5(b)). Как правило, эта операция выполняется при помощи рукоятки или рычага, которые перемещают всю призматическую конструкцию вверх и вниз вдоль оптической оси микроскопа. Фазовый сдвиг в микроскопах отраженного света, в которых для дифференциально-интерференционного контраста используется одна призма, можно создавать поперечным перемещением призмы (при помощи дискового регулятора) относительно оптической оси микроскопа. Когда микроскоп используется для работы в других режимах (светлого поля, поляризованного света, темного поля или флуоресценции), скользящую оправу вместе с призмой Номарского можно полностью убрать из оптического пути.

Для использования в режиме дифференциально-интерференционного контраста микроскопа, оснащенного одной подвижной призмой Номарского в револьверном держателе, требуются только поляризатор и анализатор. Обычно, поляризатор монтируется вместе с кремальерой или планетарным зубчатым механизмом в тонкой прямоугольной оправе, что позволяет поворачивать азимут распространения колебаний на 360 градусов при помощи дискового регулятора. Поляризатор (в оправе) вводится в оптический путь между полевой диафрагмой и полупрозрачным зеркалом через щелевое гнездо в вертикальном осветителе. Аналогичным образом, анализатор также можно поместить в оправу, позволяющую поворачивать ось распространения колебаний. Оправы с анализаторами обычно устанавливаются в щелевое гнездо, расположенное в револьверном держателе, или рядом с тубусной линзой, в верхней части вертикального осветителя. В некоторых случаях анализатор или поляризатор устанавливается в неподвижную оправу, однако, большинство микроскопов дают оператору возможность поворачивать азимут распространения колебаний, по меньшей мере, одного из поляризаторов, что позволяет осуществлять компенсацию для непрозрачных светопоглощающих образцов. Установка поляризатора и анализатора в скользящих оправах позволяет легко убирать их из оптического пути и, таким образом, работать в других режимах получения изображений. Если поляризатор остается на месте, а призма Номарского (в скользящей оправе) удаляется из микроскопа, получается конфигурация для работы в режиме поляризованного отраженного света.

Альтернативный механизм внесения фазового сдвига в оптическую систему ДИК-микроскопа отраженного света состоит в соединении компенсатора Сенармона в вертикальном осветителе с неподвижными призмами Номарского (см. рисунки 5(с), 5(d) и 6) для объективов. В сенармоновской конфигурации каждый объектив оснащается отдельной призмой Номарского, которая создает сдвиг, соответствующий числовой апертуре именно этого объектива. Призмы вклеиваются в оправы и помещаются в пыленепроницаемый блок, который устанавливается между объективом и револьверным держателем микроскопа (рисунок 5(d)). Объективы ввинчиваются в корпус призмы Номарского, который затем крепится в револьверном держателе. Призма Номарского помещается в оптический путь и выводится из него при помощи небольшого рычага (рычаг позиционирования призмы; см. рисунок 5(d)). Поскольку для ДИК-микроскопа с компенсатором Сенармона требуется несколько призм Номарского, принадлежности для такого микроскопа значительно дороже подвижной призмы Номарского для традиционного ДИК-микроскопа отраженного света.

На рисунке 6 представлена оптическая система ДИК-микроскопа отраженного света, оснащенного компенсатором Сенармона. Свет от источника освещения фокусируется собирающей линзой, проходит через апертурную и полевую диафрагмы и попадает в линейный поляризатор вертикального осветителя. Непосредственно за поляризатором в оптическом пути установлена неподвижная четвертьволновая фазовая пластинка, «быстрая» оптическая ось которой ориентирована в направлении «восток-запад» относительно стойки микроскопа. Комбинация «поляризатор — фазовая пластинка» составляет компенсатор Сенармона (рисунок 5(с)). Когда в компенсаторе Сенармона азимут распространения колебаний в поляризаторе установлен параллельно «быстрой» оси фазовой пластинки, из компенсатора выходит линейно-поляризованный пучок света, который отклоняется полупрозрачным зеркалом на 90 градусов — в оптическую систему формирования изображения.

Рис. 6. Конфигурация ДИК-микроскопа отраженного света с компенсатором Сенармона

После того, как поляризованный свет дойдет до полупрозрачного зеркала и отклонится, остальная часть оптической системы микроскопа будет работать так же, как оптическая система обычного ДИК-микроскопа отраженного света. Таким образом, на пути вниз по оптической системе микроскопа отраженного света, пучок линейно поляризованного света сначала проходит через неподвижную призму Номарского и разделяется ею, в соответствии с геометрией клиньев призмы. Затем, будучи сфокусированным линзовой системой объектива и спроецированным на непрозрачный образец, свет отражается назад в объектив, где его расщепленные составляющие сходятся в задней фокальной плоскости (совмещенной с интерференционной плоскостью призмы Номарского). В интерференционной плоскости призмы Номарского расщепленные волновые фронты воссоединяются и попадают в анализатор, где составляющие, параллельные азимуту распространения колебаний, проходят в промежуточную плоскость изображения. В плоскости изображения, между вышедшими из анализатора волновыми фронтами происходит усиливающая и ослабляющая интерференция, в результате которой и формируется ДИК-изображение.

Фазовый сдвиг в оптическую систему сенармоновского ДИК-микроскопа отраженного света вносится простым поворотом линейного поляризатора в вертикальном осветителе. Поворот азимута распространения колебаний в поляризаторе, относительно «быстрой» оси фазовой пластинки, создает разность оптических путей для ортогональных составляющих эллиптически или циркулярно поляризованного света. При повороте оси поляризатора на угол до 45 градусов в одном направлении, из компенсатора Сенармона выходит свет с правосторонней эллиптической или круговой (циркулярной) поляризацией. Поворот поляризатора в противоположном направлении создает волновые фронты с левосторонней эллиптической или круговой поляризацией. Когда ортогональные волновые фронты входят в призму Номарского и разделяются на ее поверхности, созданная поворотом поляризатора разность оптических путей (в диапазоне «плюс-минус полволны») увеличивается. Создание разности оптических путей компенсатором Сенармона аналогично эффекту, достигающемуся перемещением призмы Номарского поперек оптического пути ДИК-микроскопа традиционной конфигурации.

Характеристики образцов и их изображений, получаемых методом дифференциально-интерференционного контраста в отраженном свете

В ДИК-микроскопии в отраженном свете, разность оптических путей, создаваемая непрозрачным образцом, зависит от геометрии топографического профиля (рельефа поверхности) этого образца и от фазового запаздывания, обусловленного отражением от его поверхности расщепленных и искаженных ортогональных волновых фронтов. Рельеф поверхности большинства образцов, изображения которых получают по методу дифференциально-интерференционного контраста, изменяется в пределах сравнительно узкого диапазона (обычно, измеряющегося нанометрами или микрометрами). В связи с этим, такие образцы можно считать, в принципе, плоскими, с малыми градиентами оптического пути, изменяющимися по величине в пределах обширной поверхности. Возникающие на имеющихся в образце границах областей отражения, фазовые изменения (сдвиги) также создают разность оптических путей, повышающую контрастность ДИК-изображения. Эти фазовые различия вероятнее всего обнаружить на переходах, между различными средами, таких, как границы зерен и фазовые переходы в металлах и сплавах, либо на участках алюминия или окисла металла в интегральных микросхемах.

Несмотря на то, что в последние несколько лет ДИК-микроскопия в отраженном свете интенсивно используется для металлографических исследований образцов, наиболее широкое распространение и значимость она получила в сфере контроля качества продукции в полупроводниковой промышленности, как инструмент внутрипроизводственного технологического контроля. Более того, основные производители сегодня предлагают микроскопы, сконструированные исключительно для исследования кристаллических пластин и подложек интегральных микросхем (по методам дифференциально-интерференционного контраста, а также светлого и темного поля). Получение изображений по методу дифференциально-интерференционного контраста позволяет с высокой точностью исследовать большие объемы пластин на наличие дефектов, которые не выявляются другими методами микроскопии (см. рисунок 4). Мельчайшие вариации геометрического профиля поверхности пластины проявляются в виде теневого рельефа, а максимальный контраст достигается настройкой призмы Номарского на передачу фона в виде нейтрального серого цвета.

Перемещение призмы Номарского вдоль оптической оси микроскопа традиционной ДИК-конфигурации для отраженного света (либо вращение поляризатора в приборе с компенсатором Сенармона), создает для расщепленных волновых фронтов разность оптических путей, которая добавляется к разности, возникающей при отражении ортогональных волновых фронтов от поверхности образца. Конечным результатом является псевдо-трехмерное рельефное изображение образца, на котором участки, соответствующие более длинному оптическому пути (рельеф поверхности или границы областей отражения), выглядят более светлыми или темными, а участки, соответствующие более короткому оптическому пути, выглядят имеющими обратные (противоположные) уровни освещенности. Отличительные признаки на поверхности образца выглядят как приподнятые плато или впадины, в зависимости от ориентации градиента или характеристик отражения. В отличие от дифференциально-интерференционного контраста в проходящем свете, трехмерный вид изображения часто может использоваться в качестве индикатора фактической геометрии образца, где реальные топографические особенности также представляют собой места изменения фазовых градиентов.

После внесения фазового сдвига в оптическую систему микроскопа, теневая ориентация присутствует практически в каждом изображении, полученном по методу дифференциально-интерференционного контраста в отраженном свете. Кроме того, направление оптического сдвига становится очевидным, и может быть определено, как ось, соединяющая области изображения с наибольшими и наименьшими значениями интенсивности. Становятся различимыми особенности поверхности, поскольку для деталей образца, имеющих топографический профиль возвышенностей или впадин относительно окружающей поверхности, направление теней часто изменяется на обратное. Поскольку ось сдвига неподвижна (вследствие конструкции призмы Номарского и других ограничений, связанных с ориентацией волнового фронта в ДИК-микроскопии отраженного света), воздействовать на контраст образца путем простой настройки микроскопа (изменения направления оси) невозможно. Однако, относительный фазовый сдвиг между разделенными волновыми фронтами можно реверсировать путем перестановки призмы Номарского с одной стороны оптической оси микроскопа на другую (замена положительного значения сдвигового замедления отрицательным, и наоборот). Этого же эффекта можно достичь поворотом на соответствующий отрицательный угол поляризатора в компенсаторе Сенармона. В случае такого изменения фазового запаздывания ориентация границ светлых и темных участков изображения изменяется на 180 градусов.

Эффекты ориентации на ДИК-изображениях в отраженном свете

Как упоминалось выше, изображениям, полученным по методу дифференциально-интерференционного контраста в отраженном свете, по природе присущ выраженный азимутальный эффект. Этот эффект является результатом асимметричной ориентации светоделительной призмы Номарского относительно оптической оси микроскопа и поляризаторов. По этой причине для многих непрозрачных образцов существуют заранее определенные ограничения по ориентации, связанные с достижением максимальной контрастности изображений по методу дифференциально-интерференционного контраста (параллельно или перпендикулярно оси сдвига), и ограничивающие свободу вращения образца. Это особенно критично для высокоупорядоченных полупроводниковых пластин, где большое количество протяженных линейных участков перемежается с тесно расположенными периодическими структурами.

Рис. 7. Эффекты азимутальной ориентации на ДИК-изображениях в отраженном свете

Азимутальные эффекты микроскопии по методу дифференциально-интерференционного контраста в отраженном свете можно с выгодой использовать, оснастив микроскоп круглым предметным столиком, поворачивающимся на 360 градусов. Важнейший элемент микроскопии в поляризованном свете, поворотный столик позволяет поворачивать образец относительно оси сдвига и, тем самым, повышать до максимума или понижать до минимума контраст тех или иных деталей образца. Минимальный контраст в микроскопии по методу дифференциально-интерференционного контраста в отраженном свете достигается для линейных фазовых образцов, вытянутых вдоль направления сдвига, но при повороте столика на 90 градусов контраст может существенно изменяться. Нелинейные металлографические образцы, например, границы мозаичных структур зерен, контакты, аморфные сплавы и кристаллические сферолиты не демонстрируют существенных азимутальных эффектов в ДИК-микроскопии отраженного света, благодаря чему дают, как правило, изображения удовлетворительного качества в различных ориентациях.

На рисунке 7 представлены два образца кристалла интегральной полупроводниковой микросхемы. Оба образца характеризуются в значительной степени периодичной структурой, а их изображения, полученные по методу дифференциально-интерференционного контраста, демонстрируют высокую степень асимметрии. Рисунки 7(a) и 7(b) иллюстрируют одну и ту же область арифметическо-логического устройства микропроцессора, расположенную вблизи контактной площадки и содержащую множество шин, а также линии соединения с контактными площадками и регистры. Когда продольная (длинная) ось контактной площадки микросхемы ориентирована перпендикулярно оси сдвига (с северо-запада на юго-восток для всех изображений на рисунке 7), центральная трапецеидальная область шин получается очень темной и почти исчезает (рисунок 7(a)), теряя практически все различимые детали. Поворот микросхемы на 90 градусов (рисунок 7(b)) выявляет центральную трапецеидальную структуру шин, но приводит к потере контрастности соседних участков. Оптимальной, с точки зрения выявления всех поверхностных деталей представленной микросхемы, является такая ее ориентация, при которой продолговатая область шин располагается под углом 45 градусов к оси сдвига микроскопа.

На рисунке 7(с) представлено несколько меток совмещения фотошаблонов на поверхности полупроводника. Одна из меток расположена на металлической контактной площадке, а другая находится на гладкой поверхности оксида металла. Обе метки содержат по восемь линий одинаковой длины, расщепленных одинаковыми 45-градусными секторами. Ориентированные параллельно оси сдвига, линии метки, расположенной на поверхности оксида металла, выглядят очень темными, а верхняя левая линия метки на контактной площадке практически не видна. Линии меток, ориентированные перпендикулярно оси сдвига («северо-восток — юго-запад»), намного светлее и видны намного лучше линий другой ориентации, хотя линии, параллельные и перпендикулярные границам изображения, также видны достаточно четко.

Корреляцию между контрастом и ориентацией образца в микроскопии по методу дифференциально-интерференционного контраста, во многих случаях можно с выгодой использовать для исследования протяженных линейных структур (особенно, в полупроводниковой промышленности). Получение изображений по методу дифференциально-интерференционного контраста в нескольких ориентациях часто дает четкое представление о сложной морфологии многих протяженных линейных образцов. Более того, при сочетании метода получения оптических срезов с азимутально-специфическим получением изображений, микроскопия по методу дифференциально-интерференционного контраста в отраженном свете часто позволяет выявить такие детали, которые трудно, либо вовсе невозможно распознать при помощи других методик.

Оптическое окрашивание в микроскопии по методу ДИК в отраженном свете

Фазовым сдвигом расщепленных волновых фронтов в ДИК-микроскопии можно манипулировать за счет использования компенсационных пластин, например, пластин первого порядка (часто называемых полноволновыми или красными пластинками первого порядка), обладающих фазовым сдвигом, равным целой длине волны зеленой области спектра видимого излучения (550 нанометров). Компенсационные пластинки обеспечивают более полный контроль контрастности деталей образца относительно интенсивности и цвета фона, а также позволяют более точно настраивать сдвиг между волновыми фронтами. Кроме того, эти двоякопреломляющие компоненты часто используются для оптического окрашивания непрозрачных образцов, которые при нормальных условиях видны в ограниченном диапазоне оттенков серого.

Рис. 8. Оптическое окрашивание в ДИК-микроскопии отраженного света

Оптическое окрашивание осуществляется путем перемещения призмы Номарского поперек оптического пути на значительное расстояние от точки максимального ослабления, либо за счет установки полноволнового компенсатора позади четвертьволновой пластинки в сенармоновской конфигурации. При полнодиапазонном перемещении призмы Номарского или повороте поляризатора в компенсаторе Сенармона (связанном с полноволновой пластиной), можно наблюдать весь спектр интерференционных цветов. В микроскопе с установленным компенсатором фон окрашивается в пурпурный цвет, а контраст изображения формируется желтым цветом первого порядка и синим цветом второго порядка Ньютоновского интерференционного спектра. При таких условиях небольшие изменения сдвигового замедления в результате перемещения призмы Номарского (или поворота поляризатора в компенсаторе Сенармона) приводят к быстрым изменениям интерференционных цветов, наблюдаемых в структурах со значительной и слабой рельефностью и фазовыми градиентами отражения.

На рисунке 8 представлены изображения трех образцов, полученные по методу дифференциально-интерференционного контраста в отраженном свете, с полноволновой пластинкой, установленной за компенсатором Сенармона в микроскопе с неподвижной призмой. Рисунок 8(a) выявляет поверхностные дефекты высокотемпературного сверхпроводящего керамического монокристалла, выращенного из аморфного расплава при температуре 950 градусов Цельсия. Несмотря на то, что двойниковые дефекты в этом кристалле трудно различить без использования методов оптического окрашивания, все же, при использовании фазовой пластинки нарушения в нем достаточно очевидны, и проявляются в виде значительных флуктуаций интерференционных цветов. Аналогично, на изображении, полученном при использовании техники оптического окрашивания, в микроскопе, работающем по методу дифференциально-интерференционного контраста в отраженном свете, четко проявляется нарушение прочности связи в тонкой магнитной пленке (рисунок 8(b)). При наблюдении в белом свете, точки отрыва в пленке видны в виде складок, создающих красочный рельеф в окружении интерференционных полос. И наконец, на рисунке 8© в четком цветовом контрасте представлены детали шины интегральной микросхемы. При наблюдении интегральных микросхем по методу дифференциально-интерференционного контраста в отраженном свете могут возникать различные дифференциальные цветовые эффекты, обусловленные рядом факторов, включая наличие или отсутствие нитрид-кремниевых или полиимидных защитных покрытий, фазовые соотношения в исходных материалах и разброс параметров технологического процесса.

Хотя оптическое окрашивание можно использовать и в ДИК-микроскопии проходящего света, в отраженном свете эффективность намного выше, особенно при исследовании планарных образцов, таких, как интегральные микросхемы, где вариации поверхностного рельефа ограничены сравнительно узким диапазоном. В отличие от прозрачных образцов, для которых изображения получаются в проходящем свете, рельеф поверхности непрозрачных образцов эквивалентен геометрической толщине. Кроме того, локализованные различия фазового замедления при отражении падающего света от непрозрачной поверхности можно сравнить с вариациями показателя преломления, возникающими в образцах, исследуемых в проходящем свете. Во многих случаях применения ДИК-микроскопии в отраженном свете, детали образца часто накладываются на однородный, в фазовом отношении, фон. Этот фактор позволяет извлечь огромную пользу из повышения контрастности путем оптического окрашивания (интерференционной техники). В случае тонких прозрачных образцов, которые представляются оптимальными для получения изображений по методу дифференциально-интерференционного контраста в проходящем свете, эффективный диапазон использования оптического окрашивания сильно ограничивается (несколькими долями длины волны), что делает этот метод полезным для исследования только достаточно толстых образцов.

Получение оптических срезов в ДИК-микроскопии отраженного света

Возможность использовать для ДИК-микроскопии отраженного света объективы с большими значениями числовых апертур позволяет создавать необыкновенно тонкие оптические срезы сфокусированного изображения. Свободный от мешающих флуктуаций интенсивности, (создаваемых яркими участками), возникающих в оптических плоскостях вне фокальной точки, этот метод дает четкие изображения, являющиеся аккуратными срезами сложного трехмерного непрозрачного образца, имеющего существенно рельефную поверхность. Это свойство часто используется для получения четких оптических срезов отдельных деталей поверхности интегральных микросхем, при минимальных помехах от структур, находящихся выше и ниже фокальной плоскости.

Рис. 9. Получение оптических срезов в ДИК-микроскопии отраженного света

В микроскопии отраженного света главную роль в определении контрастности и разрешения изображения играет апертурная диафрагма вертикального осветителя. Уменьшение размера апертуры повышает глубину поля и общую резкость изображения, одновременно улучшая его контраст. Однако, при слишком малых апертурах диафрагмы становятся заметными дифракционные искажения, существенно уменьшается яркость (интенсивность) изображения и ухудшается разрешение. Зачастую, оптимальная настройка апертурной диафрагмы представляет собой компромисс между возможностью точного отображения деталей образца с достаточным контрастом и сохранением разрешения, необходимого для отображения мельчайших особенностей, не создавая дифракционных искажений.

Серия представленных на рисунке 9 изображений, полученных с большим увеличением по методу дифференциально-интерференционного контраста, иллюстрирует три отдельные фокальные плоскости (в одном и том же поле зрения) перекрывающихся поверхностных структур типичной интегральной микросхемы. При освещении по методу светлого или темного поля эти структуры часто наблюдаются слившимися, и могут создать серьезную путаницу при попытке получить изображение характерных особенностей поверхности. Изображение на рисунке 9(a) выявляет несколько контактных площадок из оксида металла на верхней поверхности кристалла интегральной микросхемы, включая перемычки (миниатюрные соединения между вертикальными слоями) и часть токопроводящей шины. Фокусировка микроскопа на несколько сотых микрона глубже выявляет многочисленные соединения в центральной части микросхемы (рисунок 9(b)). Еще глубже, вблизи первых слоев, нанесенных поверх беспримесного кремния (подложки), виден ряд соединительных дорожек из оксида металла, испещренных упорядоченным массивом точек межслойных соединений (рисунок 9(с)). Возможности ДИК-микроскопии в отраженном свете, в отношении получения оптических срезов, со всей очевидностью демонстрируются способностью создавать изображения конкретных фокальных областей на поверхности сложной интегральной микросхемы.

Заключение

Основная особенность микроскопии по методу дифференциально-интерференционного контраста, как в отраженном, так и в проходящем свете, состоит в том, что расщепленные ортогональные составляющие волновых фронтов, — прошедшие через образец или отраженные от него, смещаются относительно друг друга всего лишь на доли микрона (расстояние сдвига), что намного меньше разрешающей способности объектива. Наблюдателю совершенно не видно, что конечное изображение создается в окулярах за счет суперпозиции двух упомянутых составляющих волнового фронта, поскольку их смещение слишком мало для разрешающей способности микроскопа. Тем не менее, каждая точка изображения образуется двумя близко расположенными и перекрывающимися дифракционными кругами (дисками Эйри), порождаемыми соседними точками образца. Интенсивность каждого диска соответствует конкретной разности оптического пути, создаваемого для него (диска) образцом. Контрастность изображения описывается дифференциалом, поскольку является функцией градиента оптического пути по поверхности образца: чем круче градиенты, тем выше контрастность.

В состав основных кандидатов на исследования по методу ДИК-микроскопии в отраженном свете входит широкий спектр образцов для металлографических исследований, минералы, сплавы, металлы, полупроводники, стекло, полимеры и композитные материалы. Высокая разрешающая способность метода позволяет выявлять детали образца, имеющие размеры всего несколько нанометров. Например, изображение спиральных дислокаций высотой всего лишь 30–40 нанометров, растущих в кристалле карбида кремния, можно получить в виде высокого рельефа, а тонкие пленки, толщиной около 200 нанометров, успешно наблюдаются в желтом монохроматическом свете натриевой лампы. Микроскопия по методу дифференциально-интерференционного контраста в отраженном свете позволяет наблюдать процессы фазовых превращений (переходов) и рекристаллизации, а также мельчайшие детали на поверхности стекол и полимеров.

Несмотря на ограниченность использования, главным образом, промышленным применением, микроскопия по методу дифференциально-интерференционного контраста представляет собой мощное средство, прочно утвердившееся сегодня в сфере производства полупроводниковых приборов. Микроскопы, работающие по методу дифференциально-интерференционного контраста в отраженном свете, обеспечивают контроль качества и помогают предотвращать отказы миллионов ежегодно производимых компьютерных микросхем. Специалистам, исследующим интегральные микросхемы, приходится проводить за микроскопами бесчисленное количество часов. В связи с этим, сегодня производители уделяют особое внимание эргономическим аспектам конструкций вновь создаваемых микроскопов отраженного света. В результате, несомненно, будут создаваться все более совершенные микроскопы, позволяющие получать превосходные ДИК-изображения и сводить к минимуму дискомфорт и нейромышечные нарушения для операторов, выполняющих длительные исследования идентичных образцов.