Конфокальная микроскопия (Часть 1)

Введение в конфокальную микроскопию

Конфокальная микроскопия имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционной оптической микроскопией, включая регулируемую глубину поля, исключение ухудшающей изображение внефокусной информации, возможность последовательного анализа оптических срезов толстых образцов. Сущностью конфокального метода является использование пространственной фильтрации для отсечения света от части образца вне фокуса (фоновых засветок), когда толщина образца больше, чем фокальная плоскость. В последние годы произошел взрыв популярности конфокальной микроскопии, отчасти благодаря легкости получения изображений чрезвычайно высокого качества для образцов, подготовленных для традиционной оптической микроскопии, а отчасти благодаря большому количеству приложений во многих областях, представляющих сегодня исследовательский интерес.

Основные понятия

Хотя современные приборы значительно отличаются от самых ранних версий, принцип конфокального получения изображений, выдвинутый Марвином Мински и запатентованный в 1957 году, применяется во всех современных конфокальных микроскопах. В традиционных широкопольных микроскопах весь образец целиком освещается ртутным или ксеноновым источником света, а изображение либо наблюдается визуально, либо проецируется на устройство регистрации изображения или фотопленку. Метод же формирования изображения конфокальным микроскопом принципиально другой. Освещение осуществляется сканированием всей поверхности образца одним или более сфокусированным лучом света, обычно от лазерного дугового источника. Освещенная область образца фокусируется объективом и затем сканируется с помощью сканирующего устройства с управлением через компьютер. Последовательность световых лучей от образца распознается через точечную диафрагму (или, в некоторых случаях, щелевую диафрагму) фотоэлектронным умножителем (ФЭУ), выходные сигналы которого преобразуются в изображение, отображаемое на компьютере. Хотя неокрашенные образцы и можно наблюдать с помощью отраженного от них света, их обычно отмечают одной или более флуоресцентными красителями.

Способы получения изображения

При конфокальной микроскопии для исследования огромного количества образцов разного типа используются различные методы получения изображения. Все они основываются на технической возможности получения изображений высокой четкости, называемых оптическими срезами, в последовательности относительно толстых срезов или всего образца целиком (тотального препарата). Оптический срез является базовым элементом изображения. Сами изображения получаются при наблюдении связанных и окрашенных образцов в режимах одно-, двух-, трех- и многоволнового освещения, при этом изображения, формируемые с помощью различных методик освещения и окрашивания, будут точно соотнесены между собой. Возможно получение изображений живой клетки и развернутой во времени последовательности изображений (регистрация изображений в заданный временной интервал), а численные методы обработки, применяемые к последовательностям изображений, позволяют создать интегрированное целое изображение из серии изображений по оси z и трехмерные изображения образцов., а также представление трехмерных данных во временной последовательности, то есть четырехмерное изображение. В первых конфокальных микроскопах изображения получались с помощью отраженного света, но, в действительности, в лазерном сканирующем конфокальном микроскопе может быть применен способ получения изображения с помощью любого источника проходящего света, обычно используемого в микроскопии.

Создание изображения

Процедуры подготовки образца и получения его изображения с помощью конфокальных микроскопов — это, в основном, те, которые были разработаны в течении многих лет в традиционной широкопольной микроскопии. В биомедицине главным приложением конфокальной микроскопии является получение изображения связанных или живых клеток и тканей, которые обычно окрашиваются одной или более флуоресцентными метками. Существует большое количество различных флуоресцентных красителей, которые могут быть занесены в относительно простые протоколы и использоваться для окрашивания определенных клеточных органелл и структур. Среди огромного множества доступных красителей имеются, например, красители ядра, аппарата Гольджи, эндоплазматического ретикулума, митохондрий, а также такие красители, как флуоресцирующий фаллоидин, указывающий на полимеризированный актин в клетках. Независимо от применяемого способа подготовки образца, главное преимущество конфокальной микроскопии заключается в гибкости способов представления и анализа изображения, являющейся следствием одновременного сбора множественных изображений и их представления в компьютере в цифровой форме.

Критические аспекты конфокальной микроскопии

Получение количественных трехмерных изображений во флуоресцентной микроскопии часто осложнено артефактами, возникающими при подготовке образца, благодаря контролируемым и неконтролируемым экспериментальным величинам или проблемам расположения и компоновки микроскопа. Эта статья, написанная доктором Джеймсом Б. Поли, систематизирует наиболее общие внешние факторы, которые часто «заслоняют» результаты, полученные в широкопольной флуоресцентной и конфокальной микроскопии. Среди обсуждаемых тем — лазерная система, юстировка оптических компонентов, увеличение объективов, артефакты, связанные с обесцвечиванием, аберрации, иммерсионное масло, толщина покровного стекла, квантовый выход (квантовая эффективность), и среда образца.

Аберрации в многоцветной конфокальной микроскопии

Усовершенствования конструкции упростили конфокальную микроскопию до такой степени, что она стала обычным инструментом проведения исследований в клеточной биологии. Но поскольку конфокальные микроскопы стали мощнее, стали предъявляться более высокие требования к их оптике. На самом деле, оптические аберрации вызывающие незначительные дефекты изображения в широкопольной микроскопии, могут привести к разрушительным последствиям в конфокальной микроскопии. К сожалению, строгие оптические требования в конфокальной микроскопии часто скрыты из-за оптических систем, гарантирующих четкое изображение даже в случае слабого микроскопа. Производители оптики выпускают множество различных объективов для микроскопов, предназначенных для определенных приложений. В этой статье показывается, какое влияние компромиссные решения при создании объективов оказывают на конфокальную микроскопию.

Трехцветная визуализация в конфокальной микроскопии

Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп (ЛСКМ) обычно используется для получения цифровых изображений флуоресцентных образцов, помеченных одной, двумя и тремя метками. Использование красного, зеленого и синего (RGB) цветов наиболее информативно для представления распределения света до трех флуоресцирующих меток клетки, когда для каждого взаимного расположения используется дополнительный цвет и когда изображения разного цвета образуют единую трехцветную картину. В этом разделе мы рассмотрим упрощенную версию недавно опубликованного метода получения трехцветных конфокальных изображений с помощью популярной программы обработки изображений, Adobe Photoshop. В дополнение, обсуждаются несколько приложений по созданию протокола трехцветного изображения для представления конфокальных снимков. Стоит иметь в виду, что эти численные методы не ограничиваются изображениями, полученными ЛСКМ, и могут применяться к цифровым изображениям, импортированным в Photoshop из других источников.

Основы конфокальной отражательной микроскопии

Конфокальная отражательная микроскопия может быть применяться для получения, дополнительной информации об образце, с относительно незначительными дополнительными усилиями, поскольку методики требуют минимальной подготовки образца и перенастройки оборудования. К тому же, в конфокальной отражательной микроскопии информация о неокрашенных тканях также легко доступна, как и данные, получаемые при работе с окрашенными образцами, отражающими свет. Этот метод можно также комбинировать с более распространенными методами исследований в свете флуоресценции. Примерами недавних приложений являются регистрация неокрашенных клеток в популяции флуоресцентно окрашенных клеток и наблюдение взаимодействий между флуоресцентно окрашенными клетками, растущими на непрозрачном структурированном субстрате.

Галерея конфокальных изображений

Галерея конфокальных снимков Nikon MicroscopyU представляет собой последовательность цифровых изображений, полученных с использованием конфокального микроскопа Nikon PCM-2000, объединенного с прямым микроскопом Eclipse E-600. Последовательность изображений оптических срезов в различных плоскостях образца была получена при сканировании вдоль оптической оси микроскопа. Последовательность представлена интерактивным Java — приложением, позволяющим либо «проигрывать» серию срезов автоматически, либо прокручивать их вперед и назад, как слайды.

Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия

Было разработано несколько методов для преодоления явления плохого контраста, присущего изображениям образцов с большой толщиной, обычно создаваемым микроскопами. Конфокальная и деконволюционная методики создают существенно лучшие изображения образцов средней толщины (от 5 до 15 микрон). Изображения образцов с наибольшей толщиной (от 20 микрон и более) ухудшаются из-за воздействия большого потока внешнего света от внефокусных областей и, возможно, лучше всего получаются методами конфокальной микроскопии. С помощью этого учебного руководства образцы представлены сериями оптических срезов вдоль оси z с помощью виртуального конфокального микроскопа.

Отражательная конфокальная микроскопия

С помощью этого учебного руководства можно исследовать отдельные слои поверхности интегральных микросхем. Цифровые изображения для руководства были получены с помощью отражательного конфокального микроскопа Nikon Optiphot C200. Для каждой серии была записана последовательность оптических срезов по оси z, по мере проникновения и фокусировки микроскопа вглубь (с шагом 1 микрометр) мозаики схем на поверхности кремниевого кристалла.

Основные положения

По сравнению с традиционной, конфокальная микроскопия имеет несколько преимуществ, включая малую глубину проникновения в исследуемый образец, отсутствие фоновых засветок и возможность получать серии оптических срезов образцов большой толщины. В биомедицине главным приложением конфокальной микроскопии является получение изображения связанных или живых клеток и тканей, которые обычно отмечены одной или более флуоресцентными метками.

Рис. 1. Схема хода лучей в конфокальной микроскопии

При получении изображений флуоресцирующих образцов с помощью традиционного широкопольного микроскопа вторичное свечение, испускаемое образцом из областей вне исследования, часто влияет на четкость изображения деталей, находящихся в фокусе. Это особенно проблематично при толщине образцов более 2-х микрометров. Конфокальная микроскопия дает незначительное улучшение разрешения как вдоль оси, так и по плоскости; но именно возможность исключить фоновые засветки, возникающие во флуоресцентно-окрашенных образцах большой толщины, вызвала недавний всплеск популярности этого метода исследования. Будучи относительно простыми в управлении, большинство современных конфокальных микроскопов, стали частью базового оборудования во многих многопользовательских системах по работе с изображениями. Поскольку разрешение, достигаемое лазерным сканирующим конфокальным микроскопом (ЛСКМ) несколько лучше традиционного широкопольного оптического микроскопа, но все же значительно ниже разрешения просвечивающего (трансмиссионного) электронного микроскопа, он, в определенном смысле, явился мостом между двумя наиболее распространенными методами исследований. На рисунке 1 представлена принципиальная схема прохождения света в конфокальном микроскопе базовой компоновки.

В традиционных широкопольных микроскопах весь образец целиком освещается ртутным или ксеноновым источником света, а изображение либо наблюдается визуально, либо проецируется на устройство визуализации изображения или фотопленку. Метод же получения изображения конфокальным микроскопом принципиально другой. Освещение образца осуществляется сканированием его одним или более сфокусированным лучом, обычно лазерным (рисунок 2). Изображения, получаемые сканированием образца, таким образом, называются оптическими срезами. Эта терминология относится к неинвазивному методу исследований, когда изображения получаются с помощью сфокусированного света, а не физическим рассечением образца.

Рис. 2. Широкопольное и точечное сканирование образцов

Конфокальная микроскопия значительно упростила исследование живых образцов, сделала возможным получение данных в трех измерениях (z-серия) и более совершенным процесс получения изображений мультиокрашенных образцов. На рисунке 3 сравнивается традиционное изображение, полученное при исследовании в свете флуоресценции с эпископическим осветителем с конфокальным изображением, одних и тех же участков тотального препарата куколки бабочки с эпителием, окрашенным иодидом пропидия. Очевидно впечатляющее повышение разрешающей способности и, как следствие, резкости изображения ядер на снимке ЛСКМ, благодаря исключению внефокусного флуоресцентного свечения.

Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп (ЛСКМ) 

ЛСКМ — сейчас наиболее распространенная версия конфокальных микроскопов, применяемых в биомедицине. Во введении особое внимание уделяется именно ЛСКМ, поскольку конструкция и устройство эти микроскопов позволяет работать с ними даже начинающим пользователям. Другие конструктивные решения заняли свои специальные ниши в биологии. Для любой модели Или модификации конфокального микроскопа применимо, с незначительными изменениями, большинство правил подготовки образцов, также как и для других методик, основанных на оптических срезах, таких как деконволюционная и многофотонная методики.

Развитие конфокальной микроскопии

Считается, что изобретение конфокального микроскопа принадлежит Марвину Мински, который создал рабочий микроскоп в 1955 году. Развитие конфокальной микроскопии было во многом вызвано желанием наблюдать биологические процессы в живой ткани (in vivo) (в организме), и Мински ставил перед собой цель получить изображение нейронной сети в неокрашенном препарате живого мозга. Принципы конфокальной микроскопии, выдвинутые Мински и запатентованные в 1957 году, применяются во всех современных конфокальных микроскопах. На рисунке 1 поясняется конфокальный принцип, в применении к эпифлуоресцентной микроскопии, положенный в основу всех современных конфокальных систем, используемых при получении флуоресцентных изображений. В первоначальной конфигурации Мински использовал точечное отверстие (диафрагму), помещенную напротив циркониевого дугового источника света, используемого в качестве точечного источника света.

Рис. 3. Эпителий крыла бабочки

Свет от точечного источника фокусировался в виде точки объективом на заданной фокальной плоскости в образце и, проходя через него, фокусировался вторым объективом на второй точечной диафрагме (точечном отверстии), находящейся в фокусе с первой (они являлись софокусными, т. е. конфокальными). Лучи, проходящие через второе точечное отверстие, попадали на фотоумножитель с низким уровнем шума, генерирующий сигнал в зависимости от яркости света, исходящего от образца. Второе точечное отверстие отсекало от фотоумножителя свет, идущий из областей выше или ниже фокальной плоскости в образце. Использование пространственной фильтрации для исключения внефокусного света и засветок при работе с образцами толще фокальной плоскости является ключевым принципом конфокальной микроскопии. В своих работах Мински также описывал отражательный микроскоп с одним объективом и дихроматическим зеркалом, конструкция которого стала основой используемых сейчас систем.

Чтобы получить изображение конфокальным методом, необходимо выполнить сканирование образца сфокусированным в точку светом. В оригинальном приборе, собранном Мински, луч света был неподвижен, а сам образец двигался на вибрирующем предметном столике. Неподвижность сканирующего луча относительно оптической оси микроскопа являлась преимуществом этой установки, так как это позволяла исключить большинство дефектов оптики, которые могли бы исказить изображение. Однако, при исследования биологических образцов это могло вызывать колебания и дисторсию, в конечном итоге, приводило к потере разрешающей способности и четкости изображения. Более того, при перемещении предметного столика и образца, невозможно выполнить никаких манипуляций, таких как, например, микроинъекции флуоресцентно окрашенных клеток.

Но, независимо от способа сканирования образца, необходимо получить его изображение. А первоначальная схема Мински не создавала действительного изображения, так как выходной сигнал фотоумножителя подавался на использовавшийся в вооруженных силах осциллограф с длительным послесвечением, не имеющий записывающего устройства. Позже Мински писал, что не слишком впечатляющее качество его изображения было следствием не низкой разрешающей способности самого микроскопа, но дисплея осциллографа. Сейчас понятно, что из-за отсутствия технологий Мински не мог в полной мере продемонстрировать весь потенциал конфокального метода, особенно при визуализации биологических структур. Он указывал, что быть может именно это стало причиной того, что конфокальная микроскопия не сразу была воспринята весьма требовательным сообществом биологов, для которых всегда было приоритетно качество получаемых изображений. В то время в их распоряжении были световые микроскопы с превосходной оптикой, позволяющие наблюдать и фотографировать цветные яркоокрашенные гистологические срезы на высокочувствительную цветную пленку. В современных конфокальных микроскопах изображение формируется из сигналов, поступающих с фотоумножителя или улавливаемых цифровой камерой со встроенным прибором с зарядовой связью, непосредственно обрабатывается компьютерной системой работы с изображениями, выводится на экран с высоким разрешением и на устройство документирования изображений превосходного качества. Схема современного лазерного сканирующего конфокального микроскопа приведена на рисунке 4.

Рис. 4. Схема современного лазерного сканирующего конфокального микроскопа

Базовая оптика оптического микроскопа принципиально не менялась в течение десятилетий, поскольку конечное разрешение прибора определяется длиной волны, объективом и свойствами самого образца. Красители, используемые для усиления контраста образцов, и другие методы оптической микроскопии значительно улучшились за последние 20 лет. Подъем и совершенствование конфокального метода явились следствием возрождения оптической микроскопии, вызванного, во многом, успехами современных технологий. Многие технологические достижения, которые могли бы быть полезными в конструкции Мински, постепенно становятся доступными (в том числе и по цене) для биологов и других микроскопистов. Среди них, стабильные многочастотные лазеры, используемые в качестве улучшенных точечных источников света, усовершенствованные дихроматические зеркала, чувствительные малошумящие фотоприемники, быстродействующие микрокомпьютеры с усиленными возможностями (благодаря доступности памяти с большой емкостью), сложное программное обеспечение для работы с изображениями, мониторы с высоким разрешением и цифровые принтеры.

Эти технологии развивались независимо, и с 1955 года постепенно встраивались в конфокальные системы визуализации. Например, методы обработки цифрового изображения впервые были успешно применены в начале 80-х исследователями океанографического института Вудз Хоул (Woods Hole Oceanographic Institute). Используя, в их терминологии, «видео-микроскопы», они смогли получить изображения клеточной структуры микротрубок, размером меньше теоретического предела разрешающей способности оптического микроскопа. Очевидный рост разрешения стал возможен благодаря цифровой оптимизации изображений, захватываемых высокочувствительной суперкремниконовой (SIT) видеокамерой, соединенной с цифровым процессором изображений. Клеточные структуры были визуализованы с помощью оптики, работающей на дифференциальном интерференционном контрасте (ДИК), и дальнейшей обработки изображений цифровыми методами.

Классификация конструкций конфокальных микроскопов обычно основывается на методе сканирования образца. Существует два основных способа сканирования: сканирование предметного столика и сканирование осветительного луча; и, по крайней мере, два способа сканирования луча. В основу первоначального прибора Мински была положена система сканирования предметного столика, приводимая в движение примитивным камертонным генератором, которая создавала изображение довольно медленно. Современные конфокальные установки со сканированием предметного столика, ушедшие далеко вперед от своих прототипов, используются, в основном, в материаловедении, например, в производстве микрокристаллов. Системы, основанные на этом принципе, стали в последнее время популярны в областях биомедицины, где проводится анализ ДНК на микрокристаллах.

Более практичной альтернативой формирования изображений биологических систем является сканирование стационарного образца лучом. Этот принцип лежит в основе многих измерительных систем, усовершенствование которых привело к появлению популярных сегодня исследовательских микроскопов. В данном введении мы не касаемся технических деталей конфокальной микроскопии, но, по существу, в ней используются два принципиально отличных метода сканирования луча: многолучевое сканирование и однолучевое сканирование. Однолучевое сканирование на сегодня наиболее распространено, и именно этот метод применяется в ЛСКМ. Здесь сканирование луча производится с помощью управляемых компьютером зеркал, приводимых в движение гальванометрами со скоростью один кадр в секунду. Для достижения более быстрого сканирования, приблизительно с частотой видео кадров, в некоторых системах применяется акустооптическое устройство или колеблющиеся зеркала. В альтернативном методе используют два луча для сканирования почти в реальном времени, при этом обычно применяется разновидность вращающегося диска Нипкова. Эти системы явились результатом модификации и доводки спаренных (тандемных) сканирующих микроскопов (TSM), с целью создания более эффективных моделей для создания изображений флуоресцентно-окрашенных образцов. На рисунке 5 показана такая усовершенствованная система со спаренными дисками Нипкова и микролинзами для повышения чувствительности к слабому флуоресцентному свечению при создании изображения в реальном времени.

Рис. 5. Оптическая схема на основе дисков Нипкова

На сегодняшний день в конфокальной микроскопии существуют два альтернативных метода получения оптических срезов: метод деконволюции и многофотонный. Они различаются технически, но, как и конфокальные методы, основываются на традиционной оптической микроскопии. Деконволюция основана на вычислительных алгоритмах расчета и удаления той информации, которая поступает при создании изображения из внефокусных областей. Эта методика стала весьма удобной благодаря эффективным алгоритмам и высокопроизводительным миникомпьютерам. Многофотонная микроскопия использует ту же сканирующую систему, что и ЛСКМ, но не требует наличия точечной диафрагмы в приемнике. В ней нет необходимости, так как лазер возбуждает флуорохромную метку только в точке фокуса, исключая тем самым внефокусное излучение. При наблюдении живых тканей у этого способа появляются дополнительные преимущества, а именно: снижение фотообесцвечивания, поскольку уменьшается количество энергии, передаваемой лазерным лучом и поглощаемой тканями образца.

Традиционный оптический микроскоп представляет собой базу, на которой строится ЛСКМ. Вместо вольфрамовой или ртутной лампы применяется лазер, который связан с чувствительным фотоумножителем (ФЭУ) и компьютером, управляющим сканирующими зеркалами и другими сканирующими устройствами, а также облегчающим сбор и представление изображений. Полученные данные хранятся на цифровых носителях и могут быть обработаны с помощью многочисленных пакетов программ, либо на компьютере самой системы, либо на каком-нибудь другом.

По конструкции ЛСКМ, освещение и прием (регистрация) сигнала ограничиваются точкой на образце с дифракционным пределом. Объективы микроскопа сводят пятно освещения в фокус, и сканирующее устройство выполняет сканирование образца этим пятном под управлением компьютера. Сигналы от светящихся точек образца попадают в фотоумножитель через точечную (или, в некоторых случаях, щелевую) диафрагму, а выходные сигналы ФЭУ формируются в изображение и визуально воспроизводятся компьютером. Хотя неокрашенные образцы можно наблюдать в отраженном от образца свете, обычно они окрашиваются одной или более флуоресцентными красителями. Один из наиболее распространенных ЛСКМ, описанный в литературе примерно в 1990 году, был разработан в ответ на фундаментальную проблему, с которой столкнулись биологии-исследователи. Многие структуры и отдельные макромолекулы внутри иммунофлуоресцентно окрашенных зародышей невозможно визуализировать традиционным эпифлуоресцентным микроскопом после двухклеточной стадии, поскольку при возрастании числа клеток объем эмбриона остается примерно таким же. Это означает, что при более плотном расположении клеток усиливается свечение от клеток вне фокальной плоскости, что приводит к ухудшению разрешения изображения.

Рис. 6. Конфигурация лазерного сканирующего конфокального микроскопа Nikon

Группа исследователей, работающих над этой проблемой, обнаружила, что ни одна из доступных в то время конфокальных систем не отвечает их требованиям. На то время микроскопы со сканированием предметного столика работали слишком медленно. На создание одного изображения уходило примерно 10 секунд, а приборы с многолучевым сканированием еще не подходили для флуоресцентной визуализации с практической точки зрения. ЛСКМ был разработан таким образом, чтобы удовлетворять требованиям традиционной эпифлуоресцентной микроскопии и, наряду с другими, разрабатываемыми в то же время, стал прообразом сложных систем, предлагаемых сейчас биомедицинскому сообществу различными фирмами. Пример применяемой сегодня системы (Nikon E1000) приведен на рисунке 6.

В специально разработанных приборах толщина оптических срезов может меняться с изменением диаметра точечного отверстия перед фотоприемником. В сравнении с другими конструкциями с фиксированным размером точечного отверстия эта дополнительная функция оказывается чрезвычайно гибкой при визуализации биологических структур. Изображение может быть увеличено без потери разрешения за счет сокращения сканируемой площади образца и помещения отсканированной информации в массив данных того же размера для хранения и визуального представления (подобным образом меняется увеличение и в сканирующем электронном микроскопе). Благодаря этому у одного объектива появляется интервал изменения масштаба, что может быть чрезвычайно полезным при визуализации редких или скоротечных событий, которые могут быть пропущены или потеряны при смене объектива.

Благодаря детально проработанным и гибким возможностям ЛСКМ, предлагаемых сейчас коммерческими фирмами по приемлемым ценам, в последние годы произошел взрыв популярности конфокальной микроскопии, когда многие многопользовательские лаборатории предпочитают это оборудование электронным микроскопам. Преимуществом конфокальной микроскопии является относительная легкость, с которой могут быть получены высококачественные изображения образцов, приготовленных для традиционной оптической микроскопии, и большое число приложений в различных областях исследований.

Первое поколение ЛСКМ хорошо работало с зафиксированными образцами, но им не удавалось контролировать световую энергию лазеров, что слишком часто приводило к фатальному разрушению живого образца, если не предпринимались серьезные меры предосторожности. Несмотря на эти ограничения, изображения зафиксированных образцов были настолько качественными, что конфокальный подход был безоговорочно принят специалистами. В приборах последующих поколений был усовершенствован каждый аспект процесса визуализации. В дополнение к этому, новые приборы стали значительно эргономичней и удобней в работе, так что юстировка, смена комбинации фильтров, регулировка мощности лазера, производимые с помощью компьютера, стали гораздо легче и быстрее. Сейчас возможно снимать изображения с тремя флуорохромами одновременно, а последовательно — с еще большим числом. Благодаря усовершенствованному и более надежному программному обеспечению, повышению быстродействия компьютеров, увеличению емкости дисков и падению цен на оперативные запоминающие устройства, процесс обработки изображения тоже значительно продвинулся вперед.

Режимы формирования изображения

Основным применением конфокального микроскопа является получение изображений толстых образцов различного типа. Преимущество конфокального метода проистекает из возможности создавать изображения образца как последовательность отдельных оптических срезов высокой четкости и разрешения. При этом используется несколько режимов визуализации; в основе каждого из них лежит оптический срез, как базовая единица изображения.

Рис. 1. Оптические срезы, меченные тремя метками

Отдельные оптические срезы

Оптический срез является базовой единицей изображения в методах конфокальной микроскопии. Могут быть получены изображения связанных и окрашенных образцов в режиме одно-, двух-, трех- и многоволнового освещения, при этом изображения мультиокрашенных образцов, будут совмещены друг с другом (если используются объективы с адекватной коррекцией хроматической аберрации). Дополнительное совмещение обычно производится методами цифровой обработки изображения. Большинству лазерных сканирующих конфокальных микроскопов (ЛСКМ) требуется примерно 1 секунда на получение оптического среза, хотя, обычно, изображения нескольких оптических срезов усредняются для улучшения отношения сигнал — шум. Время получения изображения, конечно, зависит от размеров изображения в пикселях и быстродействия компьютера системы. Для хранения типичного 8-битного изображения размером 768×512 пикселей потребуется около 0.3 Мбит памяти.

Представленные на рисунке 1 оптические срезы получены одновременно при облучении возбуждающим светом трех различных длин волн (488, 568 и 647 нанометров) при использовании одного криптонового / аргонового лазера в качестве источника излучения. В качестве образца представлен имагинальный диск крыла дрозофилы на третьей возрастной стадии, в котором помечены три гена, участвующих в формировании крыла. Три представленных гена и соответствующие флуорохромные метки таковы: (a) рудиментарный (флюоресцеин — 496 нанометров); (b) бескрылый (лиссамин родамин — 572 нанометров); и © CiD (цианин 5 — 649 нанометров). Комбинированное изображение трех пространственно представленных доменов генов, формирующих крыло, располагается внизу справа (изображение (d)).

Съемка в заданный временной интервал и визуализация живой клетки

Исследования живых клеток в заданный временной интервал приобрело новый импульс благодаря повышению разрешающей способности ЛСКМ. Ранее исследования движений клеточных структур проводились с использованием 16-миллиметровой фотопленки и интервалометром с часовым механизмом, соединенным с фотокамерой, позже с помощью видеомагнитофона с функцией цейтраферной съемки, оптического устройства записи на диск или платой оцифровки видеоизображений. Сейчас с помощью ЛСКМ можно получать оптические срезы через определенные, предварительно заданные интервалы в режиме реального времени.

Визуализация живых тканей с помощью ЛСКМ гораздо сложнее, чем получение изображения связанных образцов, и не всегда возможна практически, поскольку образец может не выдержать условий наблюдения. В таблице 1 приведены некоторые факторы, которые необходимо учитывать при наблюдении живых и связанных клеток с помощью ЛСКМ. Некоторые образцы просто физически невозможно поместить на предметный столик микроскопа, или они не смогут оставаться живыми на нем в течении всего периода наблюдения. Исследуемое явление или структура могут не попадать в поле зрения объектива. Например, имагинальные диски крыла дрозофилы развиваются слишком глубоко в личинке, поэтому их невозможно наблюдать; а после препарирования, они не могут развиваться в культуре. Поэтому сегодня единственный доступный метод наблюдать экспрессию генов в тканях такого типа — рассечь личинку, связать и окрасить имагинальные диски, взятые из образцов на разных стадиях развития.

Табл. 1. Наблюдение связанных и живых клеток с помощью ЛСКМ

Критерий	Связанные клетки	Живые клетки
Ограничения по освещению	Выцветание флуорофора	Фототоксичность и выцветание красителя
Реагент против обесцвечивания	Фенилендиамин и т.д.	НЕТ!
Гистологическая среда	Глицерин (n = 1.51)	Вода (n = 1.33)
Наибольшая апертура линз	1.4	1.2
Время на изображение	Неограниченно	Ограничено длительностью явления; чувствительностью образца к свету
Усреднение сигнала	Да	Нет
Разрешение	Волновая оптика	Статистика фотонов

Успешное наблюдение и создание изображений живых клеток требует чрезвычайной осторожности в течение всего процесса, Обязательным условием является поддержание приемлемых условий на предметном столике микроскопа. Повреждения, наносимые клетке при облучении лазерным лучом, могут накапливаться при многократном сканировании, поэтому это воздействие должно быть сведено к минимуму, необходимому и достаточному для получения изображения. В культуральную среду обычно добавляются антиоксиданты, например аскорбиновая кислота, для сокращения кислорода, выделяемого при облучении флуоресцентных молекул светом возбуждения, и способствующего образованию свободных радикалов, убивающих клетки. Обычно необходимо проводить всесторонние предварительные контрольные опыты для оценки влияния облучения на флуоресцентно окрашенные клетки, внимательно следя за соответствием всех параметров изображения проводимому наблюдению. Вслед за пробными изображениями необходимо оценить жизнеспособность живых образцов. Эмбрионы, например, должны продолжать свое нормальное развитие в течение всего процесса наблюдения, поэтому необходимо выявлять любые аномалии, вызванные воздействием облучения или флуорохромами. На рисунке 2 представлена съемка в заданный временной интервал эмбриона дрозофилы, флуоресцентно окрашенного зеленым кальцием. Серия снимков показывает изменение распределения флуоресцентного свечения во времени.

Каждый тип клеток требует своих мер для поддержания их жизнеспособности в процессе наблюдения. Для некоторых клеток насекомых достаточно поддержания комнатной температуры и наличия достаточно большого объема подходящей среды. Однако, большинство типов клеток требуют подогрева предметного столика и, иногда, перфузионной камеры для поддержания необходимого баланса углекислоты в течение их нахождения на предметном столике. Выбор типа клеток, для которых условия наблюдения с помощью ЛСКМ наименее «враждебны», поможет избежать многих экспериментальных проблем. Усовершенствования современных конфокальных приборов привели к существенному сокращению потенциальных проблем. Повышенная квантовая эффективность, большая числовая апертура (яркость) объективов и использование менее токсичных красителей для клеток привели к тому, что конфокальная микроскопия стала практичным методом анализа живых клеток. Необходимо стремиться к использованию лазеров меньшей мощности, позволяющих, в то же самое время, выполнять регистрацию и обработку изображений как можно быстрее. Если для ускорения сбора и регистрации изображений увеличивается апертура точечной диафрагмы (по сравнению с наблюдением неживых образцов), то последующая деконволюция может иногда восстановить потерянное качество снимка.

Рис. 2. Съёмка в заданный временной интервал

Многие физиологические процессы и события протекают слишком быстро, и поэтому не могут быть захвачены большинством ЛСКМ, скорость визуализации которых в среднем один снимок в секунду. ЛСКМ, использующие акустооптические устройства и щелевые диафрагмы, быстрее возбуждаемых гальванометром точечных сканирующих систем и более практичны для физиологических исследований. Эти более быстрые установки соединяют хорошее пространственное и временное разрешение, которое может достигать 30 кадров в секунду при полноэкранном разрешении, или быть близким к скорости видео изображения. В более медленных микроскопах, со сканированием через точечное отверстие, временное разрешение может быть увеличено только за счет уменьшения области сканирования образца. Если необходимо полное пространственное разрешение, частота кадров должна быть уменьшена, что ведет к потере временного разрешения. Конфокальные системы, в которых применяются сканирование диском или колеблющимся зеркалом, также способны визуализировать быстрые физиологические процессы или другие скоротечные события.

Z-серия и трехмерные изображения

Z-серия — это последовательность оптических срезов образца, выполненных на разных уровнях в плоскости, перпендикулярной оптической оси (z-ось). Z-серии изображений получаются путем согласования пошаговых изменений в тонкой фокусировке микроскопа с последующим получением изображения на каждом шаге. Пошаговое перемещение фокуса обычно выполняется шаговым двигателем под управлением компьютера, который изменяет фокус на заданную величину. С помощью макропрограммы компьютера можно получить и сохранить изображение, перефокусировать микроскоп на заданную глубину в образце, получить и сохранить второе изображение, опять произвести рефокусировку в новой плоскости и так далее, пока не будет получено запрограммированное число изображений.

Нужные изображения могут быть взяты из z-серии, полученной при съемке выбранной области образца и обработаны специальной программой для последующего детального исследования определенных клеток, представляющих интерес. Z-серия может быть представлена как фотомонтаж изображений, как, например, на рисунке 3. Этот тип комбинации и отображения изображений, а также многие другие операции с изображениями, входит в стандартный набор свойств современных пакетов программного обеспечения по работе с изображениями. Снимки на рисунке 3 являются выборкой из большей серии с еще более частым шагом по оси z. Зеленое свечение определяет периферийную нервную систему эмбриона дрозофилы, окрашенного антителом 22C10.

Рис. 3. Z-серия оптических срезов

По сериям из нескольких сотен оптических срезов образца, произведенных ЛСКМ, может быть трудно составить представление обо всем комплексе взаимосвязанных структур. Тем не менее, z-серия, после регистрации, является идеальным материалом для последующего трехмерного представления образца с помощью методик объемной визуализации. Этот подход сейчас повсеместно используется для прояснения отношения между структурой и функцией тканей в медицине и биологии. Важно задать правильный шаг z-сканирования образца определяемый шагом двигателя, изменяющего фокус; в этом случае снимок будет отражать действительную глубину образца.

До тех пор, пока образец остается неподвижным при его наблюдении, снимки z-серии, произведенной ЛСКМ, будут превосходно зарегистрированы, а сохраненные в цифровом формате, они будут относительно легко преобразованы в трехмерное представление образца. На рисунке 4 сравнивается отдельный оптический срез (a) с проекцией z-серии (b) и иллюстрируется ценность этой методики при визуализации периферийной нервной системы эмбриона дрозофилы, меченного антителом 22C10.

Шаг шагового двигателя, устанавливаемый оператором микроскопа, связан с толщиной оптического среза, но может иметь другое значение. Толщина оптического среза привязана к толщине среза образца, наблюдаемого в микроскоп, и зависит от объектива и диаметра точечной диафрагмы. В некоторых случаях, тем не менее, шаг фокуса может совпадать с толщиной оптического среза, и это может приводить к путанице.

Вслед за получением файла z-серии, его отправляют на обработку программой трехмерной реконструкции, специально разработанную для обработки конфокальных изображений. Такие программы обладают чрезвычайным быстродействием при использовании на графических станциях, но могут быть успешно использованы и на персональном компьютере или графической станции самого конфокального микроскопа, при достаточно быстром процессоре и наличии большой оперативной памяти. С помощью этих программ можно создавать как отдельные трехмерные представления образца, так и последовательность представлений, сменяющих друг друга, составленных по разным видам образца, что производит эффект вращения или других пространственных трансформаций и дает лучшее восприятие трехмерных свойств образца. Программа позволяет варьировать длину, глубину, производить объемные измерения, а также интерактивно менять специальные параметры изображения, такие как прозрачность образца, для выделения различных структур в разных уровнях образца.

Рис. 4. Оптический срез и проекция z-серии

Другой способ представления серии оптических срезов, взятых из последовательности снимков, полученных в заданный временной интервал — это трехмерное представление, в котором ось z имеет функцию временной оси. Этот подход полезен при визуализации физиологических изменений при развитии организма. Примером применения этого метода было прояснение динамики изменения концентрации кальция в процессе развития эмбрионов морского ежа. Цветовое кодирование оптических срезов, взятых на разной глубине — простой способ представления трехмерных данных. На практике, цвет (обычно красный, зеленый или синий) приписывается каждому оптическому срезу, полученному на разной глубине образца, а затем цветные изображения объединяются, и за счет изменения цветов с помощью программы обработки изображений достигается желаемый эффект.

Получение четырехмерных изображений

С помощью ЛКСМ, динамические явления, проявляющиеся в живых тканях или в процессе подготовки живых тканевых культур и отраженные в последовательности снимков, полученных в заданный временной интервал, могут быть представлены в четырехмерном виде, со временем в качестве четвертого измерения. Z-серии, полученные через определенные интервалы, представляют собой четырехмерные наборы данных: три пространственных измерения (x, y и z) и время, в качестве четвертого, что можно наблюдать с помощью программы 4D просмотра. Такие программы позволяют составлять и проигрывать как кинофильм, стереопары, взятые в разные моменты времени, или, альтернативно, обрабатывать и представлять воссозданные трехмерные изображения, снятые в разные моменты времени, как смонтированный фильма.

X-Z изображения

Если необходимо получить вид образца сбоку, как, например, вертикальный разрез эпителиального слоя, можно произвести x-z сечение одним из двух способов. Вид сбоку можно получить сканированием по одной линии образца (ось x) с разной глубиной (ось z), контролируя шаговым двигателем изменение фокуса, а затем объединяя всю серию срезов в единое изображение. Другим методом является использование опции плоскость разреза в программе воссоздания трехмерных изображений, когда вид сбоку выделяется из существующей z-серии оптических срезов. При формировании изображения эпителия крыла бабочки на рисунке 5, лазер сканировал по одной линии (горизонтальная черная линия на левом снимке) проникая в образец при разных значениях z-координаты, или глубины. X-z изображение, представленное на рисунке 5, было построено и представлено конфокальной системой визуализации. Эпителий крыла состоит из двух эпителиальных слоев, но, поскольку интенсивность флуоресцентного свечения падает с увеличением глубины проникновения лазерного луча в образец, четко визуализирован только верхний слой.

Рис. 5. Изображение в X-Z плоскости

Создание изображения в отраженном свете

Все ранние конфокальные микроскопы работали в отраженном, или обратно рассеянном свете. Используя отраженный свет, многие образцы в конфокальной микроскопии можно наблюдать неокрашенными, либо они могут быть помечены красителями с высокой отражающей способностью, как, например, иммунозолотом или микрокристаллами галогенидов серебра. Преимущество наблюдений в отраженном свете, особенно для живых тканей, состоит в том, что образец не подвергается фотообесцвечиванию. Но красители некоторых типов могут ослаблять лазерный луч. Другой потенциальной проблемой является то, что в некоторых микроскопах могут возникать внутренние отражения от оптических элементов на оптическом пути луча. Для многолучевых версий ЛСКМ и ЛСКМ со щелевой диафрагмой проблемы отраженного света не существует, а в тех микроскопах, где она есть, применение поляризаторов, визуализация областей без артефактов и смещение от оптической оси, помогают уменьшить проблему.

Создание изображений в проходящем свете

Любой из режимов визуализации в проходящем свете, обычно применяемый в микроскопии, может быть использован в ЛСКМ, включая фазовый контраст, дифференциальный интерференционный контраст (ДИК), темное поле или поляризованный свет. Свет, прошедший через образец попадает на приемник проходящего света, сигнал которого, через волоконно-оптически й световод, направляется в один из фотоумножителей в сканирующей головке микроскопа. Изображения в проходящем свете и конфокальные эпифлуоресцентные изображения могут захватываться одновременно при использовании одного и того же луча от осветителя, что гарантирует их точную регистрацию. При объединении или синтезе изображений с помощью соответствующего программного обеспечения, может быть отражено точное положение меченых клеток в ткани. В некоторых исследованиях предлагается следующий содержательный подход: объединить неконфокальное изображение в проходящем свете с одним или более конфокальных флуоресцентных изображений меченых клеток того же образца. Такой подход позволит, например, определить пространственные и временные аспекты миграции субпопуляции меченых клеток в пределах популяции немеченых клеток в течение нескольких часов или даже лет.

Сегодня уже широко используется цветной приемник проходящего света, который принимает проходящие сигналы в красном, зеленом и синем цвете (RGB) для создания цветного изображения в реальных цветах, подобно тому, как это делается в некоторых цифровых цветных фотоаппаратах. Такой приемник особенно полезен для патологоанатомов, которые обычно наблюдают реальные цвета в тканях в проходящем свете и накладывают эти изображения на флуоресцентные данные для анализа.